一种新型大鼠高血压模型的建立方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种新型大鼠高血压模型的建立方法及其应用。本发明专利技术公开的新型大鼠高血压模型的建立方法，该方法包括步骤有：(a)提供人内含子源性27nt‑miRNA序列，构建其高表达质粒；(b)将(a)步骤中的高表达质粒与X‑treme GENE HP DNA转染试剂按一定比例混合，经生理盐水稀释后，通过大鼠尾静脉瞬时高速注射进入SD大鼠体内，致使大鼠血压升高，并维持高压状态，从而形成一种新型的大鼠高血压模型。本发明专利技术的大鼠高血压模型是一种有效的动物疾病模型，可用于验证人内含子源性27nt‑miRNA对正常大鼠血压、血管舒张因子的影响，可用于降压药物的筛选，应用前景较广。

Establishment and application of a new hypertensive model in rats

The invention discloses a method for establishing a new rat hypertension model and its application. The present invention discloses a new method for establishing rat hypertension model. The method comprises the following steps: (a) providing human intron-derived 27nt microRNA sequence to construct its high expression plasmid; (b) mixing (a) the high expression plasmid in step with X treme GENE HP DNA transfection reagent in a certain proportion, diluting with normal saline, and injecting it into SD rat body at high speed and instantaneously through rat tail vein. Internally, it causes the blood pressure of rats to rise and maintain the state of high pressure, thus forming a new type of rat hypertension model. The rat hypertensive model of the present invention is an effective animal disease model, which can be used to verify the effect of human intron-derived 27nt microRNAs on blood pressure and vasodilator factors in normal rats, and can be used for screening antihypertensive drugs with wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种新型大鼠高血压模型的建立方法及其应用
本专利技术涉及基因重组以及动物瞬时注射
，具体涉及一种新型大鼠高血压模型的建立方法及应用。
技术介绍
心血管疾病是当今全球发病率与死亡率最高的疾病之一，高血压病则是最常见的心血管疾病，同时被称为严重危害人类健康的“第一杀手”。世界卫生组织(WHO)对高血压定义为：在未使用抗高血压药物的情况下，收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg。高血压又被分为1、2、3级：1)1级高血压，又称轻度高血压，收缩压140～159mmHg或舒张压90～99mmHg；2)2级高血压，又称中度高血压，收缩压160～179mmHg或舒张压100～109mmHg；3)3级高血压，又称重度高血压，收缩压≥180mmHg或舒张压≥110mmHg。此外，根据高血压患者是否同时具有危险因素，还可以分为低危、中危、高危和极高危组。据统计高血压患者全球达10亿，中国达2亿，美国在5千万以上；值得关注的是,美国心脏协会在2017年底修改高血压标准为收缩压≥130mmHg和/或舒张压≥80mmHg,显示高血压的防治越来越引起高度重视；按照修改后的高血压标准，全球高血压患者的数目至少将翻一倍以上。高血压病初期，大部分的患者是无症状的，或偶尔出现头晕、头痛等不典型症状，患者没有感觉或感觉不深，但是没有感觉并不代表没有损害。一些身体的症状不易被发现，如全身细小动脉痉挛，随着病情的发展，细小动脉却在渐渐发生硬化。这种变化，多发于冠状动脉，脑动脉、肾动脉，所以说高血压没有症状，不代表没危害，它会慢慢破坏患者的心、脑、肾器官。如果长期不治疗，高血压的危害会最大化，持续的高血压会引起严重的心、脑、肾等器官损伤或疾病，从而导致各种并发症，严重影响健康甚至生命。miRNAs与高血压的关系。有关研究表明，miRNA参与高血压发生发展的多个环节，主要有以下几个方面：1)miRNAs影响血管内皮细胞功能。持续的血管腔内高压导致内皮细胞功能障碍，失去功能性微血管、血管生成缺陷加重高血压与相关器官损害。miR-125a/b-5p抑制血管内皮细胞内皮素-1的表达，而miR-155又能引起内皮eNOS转录下调、NO等血管活性因子释放降低，从而影响血压调节。2)miRNAs参与肾素-血管紧张素-醛固酮系统功能调节。血管紧张素Ⅱ是RAAS系统的主要生物效应分子，既能使小动脉血管收缩，又能激活交感神经系统，促进醛固酮产生。miR-181a抑制肾交感神经活性和降低肾素的分泌；血管紧张素转换酶(ACE)是miR-143/145的靶基因，miRNA143/145增加导致ACE基因表达减少；miR-421抑制ACE2蛋白转录表达；miR-124和miR-135a可以通过降低盐皮质激素受体蛋白，抑制肾盐潴留；miRNA对RAAS系统产生的这些抑制效应将会降低血压。3)miRNAs参与血管平滑肌细胞增殖和分化调节。高血压病理过程中，血管平滑肌细胞的增殖和分化异常、纤维组织增生肥厚是导致血管病理性重构和管腔狭窄的主要因素。miRNA-143和miRNA-145通过抑制平滑肌细胞增殖，促进细胞的分化，miR-204、miR-124参与调控血管平滑肌细胞及成纤维细胞调节血管内膜重构，而miR-9靶向调控肥厚性通路的活化T细胞核因子C3(NFATc3)和心肌素，逆转肥厚性转变。人内含子源性27nt-miRNA是由eNOS第四内含子27碱基重复子重复4次产生。eNOS是人组织特异性基因一氧化氮合酶，是NOS的三种亚型中的一种，主要存在于血管系统的内皮细胞中。eNOS基因位于人类第7号染色体上，编码一个由1203个氨基酸构成的约为1.40×105的蛋白质。它不仅参与各种细胞生理过程的调节，如增殖、迁移、凋亡等，参与机体的血压调整、调节血管通透性、防止血小板聚集等，更与休克、高血压、动脉粥样硬化、血管狭窄和阻塞等重要病理过程的发生、发展相关。eNOS的基因多态性。组织特异性基因eNOS具有基因多态性，主要为点突变和片段缺失。点突变是指eNOS的5’端第786位的胸腺嘧啶突变为胞嘧啶(T-786C，rs2070744)或者是第七外显子上894位的鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶(G-894T，rs1799983)。片段缺失则是指eNOS的基因序列中第4内含子内存在一种27个碱基(5’-GAAGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3’)的数目可变串联重复序列(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)，该VNTR重复4次为a，重复5次为b，则产生aa、ab、bb三种不同基因型。eNOS基因多态性已被证明在在心血管等疾病中扮演重要的角色，eNOS基因变异的位置不同导致的心血管疾病也不同。本专利技术中所使用的27nt-miRNA为aa基因型。舒张因子一氧化氮(Nitricoxide,NO)。由eNOS介导L-精氨酸降解产生的NO，是重要的体液调节因子，可以调节血管舒张、维持血管血压稳定、防止抗血小板凝集等过程，其表达异常与血管功能障碍相关性疾病密切相关。正常生理条件下，eNOS被多种递质激活后导致NO在内皮细胞中增加，NO扩散出内皮细胞进入邻近平滑肌细胞，激活磷酸鸟苷从而使肌肉舒张、血管扩张和脑血流量增加。NO还可减少血小板的黏附和白细胞的聚集，抑制血管平滑肌细胞增生，防止低密度脂蛋白氧化以及抑制血管收缩因子内皮素及血管紧张素的作用，因此NO具有抗早期动脉粥样硬化的作用。在不同的状态下，eNOS表达与活性有所不同，比如年龄的增长或者动脉粥样硬化等疾病状态下，eNOS表达与活性下降，从而导致代谢产物NO的释放减少。这些被认为是心血管疾病发生发展的重要危险因素。高血压动物模型研究进展。高血压病是多种因素形成的疾病，与环境因素和遗传因素有关。自1934年Goldblatt证实，狭窄狗肾动脉可产生持续性高血压，世界各地相继开展了高血压病的动物实验研究，建立了不同的高血压动物模型。而研究高血压发病机制和防治的关键是复制理想的高血压动物模型。目前已有的高血压动物模型包括急性高血压动物模型和慢性高血压动物模型。高血压动物模型的种类。现有的高血压动物模型主要有以下几种：(1)自发型高血压动物模型。即未经任何有意识的人工处置而具有相对遗传性的实验动物在自然培育状态下产生高血压的动物模型。现阶段属Wistar品系大鼠培育的自发型高血压大鼠(spontaneouslyhy-pertensiverat，SHR)模型和脑卒中SHR应用最为常见。(2)诱发型高血压动物模型，即模拟人类某些继发性高血压的发生和发展过程，运用多种诱导方式使实验动物产生高血压。按其制模方法的不同又分为不同类型：肾脏手术高血压大鼠模型、神经源性高血压大鼠模型和内分泌、代谢和饮食型高血压动物模型。(3)基因工程高血压模型，即通过基因编辑等技术形成的高血压动物。目前尚无体外注射内含子源性miRNA导致动物血压持续升高，并最终维持稳定高压状态的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型大鼠高血压模型的建立方法，以用于验证高血压相关基因的研究，以及分子型降压药物的筛选。本专利技术的另一目的在于在动物水平验证人内含子源性27nt-miRNA对血压及血管舒张因子的影响。为达到上述目的，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型大鼠高血压模型的建立方法，其特征在于，应用人内含子源性27nt‑miRNA高表达质粒诱导正常大鼠血压升高，形成大鼠高血压模型。

【技术特征摘要】
1.一种新型大鼠高血压模型的建立方法，其特征在于，应用人内含子源性27nt-miRNA高表达质粒诱导正常大鼠血压升高，形成大鼠高血压模型。2.权利要求1的一种新型大鼠高血压模型的建立方法，其特征在于，包括的步骤如下：(1)人内含子源性27nt-miRNA高表达质粒的构建1)设计人内含子源性27nt-miRNA核苷酸序列2)根据上述核苷酸序列，用DNA合成技术得到第一链DNA,接着通过DNA连接反应合成双链DNA，通过PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧和生，罗雪兰，
申请(专利权)人：广西国际壮医医院，
类型：发明
国别省市：广西,45