一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种调控柽柳盐耐性的关键基因TcSBP5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。TcSBP5表达的蛋白产物为柽柳SBP转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术通过转化拟南芥，得到超表达TcSBP5基因的拟南芥，其种子的耐盐萌发率显著下降，其植株的耐盐性生理指标显著下降，总体表现出生长抑制的典型盐敏感表型，说明了该基因为重要的调控植物耐盐性的关键因子，在林木耐盐性育种领域有重要应用价值。

TcSBP5, a key gene regulating salt tolerance in Tamarix Tamarix and its application

【技术实现步骤摘要】
一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5及其应用。
技术介绍
据联合国粮农组织统计，陆地总面积的6.5％为无法耕种的盐碱地，我国盐碱地面积约20多万平方公里，盐碱地产生高盐胁迫，直接影响作物产量，通过抗逆育种手段充分利用盐碱地，对增加作物产量、解决粮食危机意义重大。尽管在在拟南芥、水稻等模式物种中已经阐明了一些普遍的耐盐机制，但很多耐盐基因研究表明，目前应用这些基因的转基因植物耐盐性提高的效果并不理想，不能满足在实际生产中的需求，难以推广(Zhu，2002)。相比草本植物和禾本科作物，耐盐树种具有独特的高度耐盐的优良特性，可以在高度盐碱化的盐渍化土壤、滩涂上正常生长并完成整个生活史，目前仅仅在生理层面解析了相关机制，如泌盐、离子区域化等特有机制，但是其分子层面了解较少，迫切需要阐明其高耐盐调控机理，为获取高耐盐性的转基因植株提供有效的理论指导。中国柽柳(TamarixchinensesLour.)作为耐盐性最强的树种之一，是研究植物耐盐机制的良好材料。柽柳是我国乡土树种，在维持黄河三角洲等海滨湿地盐渍化地区的生态稳定中发挥了重要作用重，也是我国沿海防护林构建的重要资源(李艳华等，2000；赵明范等，1997)。柽柳具有独特的耐高盐胁迫特有机制，挖掘其耐盐性调控关键基因，对植物耐盐机理研究意义重大，可以为盐渍地脱盐、抗逆植物育种提供理论基础，目前在柽柳属的其他物种中已经克隆得到了几十个相关的抗逆基因，为植物耐盐育种提供了重要分子工具，但在我国分布面积最广的柽柳中尚未有耐盐调控基因的报道，急需开展其耐盐调控基因的分离鉴定。SBP(或SPL)转录因子是多功能的植物转录因子家族，在植物的生长发育调控中发挥重要作用，其蛋白结构域SBP-box在植物不同物种中广泛存在且具有高度保守性。SBP-box由约80个氨基酸残基构成，具有2个特异性的锌指结构和1个核定位信号，能够识别并结合GTAC回文序列为核心的顺式元件。系统进化分析表明SBP家族在陆生植物未分化前已经存在，且大部分SBP成员含有miR156响应元件。近年来研究发现，SBP转录因子除了参与植物花器官发育和叶形态建成、果实发育、孢子发育，还和赤霉素信号转导、低温胁迫、热胁迫和铜离子胁迫有关(Guoetal.，2008)，如热胁迫诱导的拟南芥miR156使得SPL下调，转基因植株耐热性提高但生长减慢；而在低温环境下，超表达miR156的拟南芥通过抑制SPL3翻译，导致开花基因FT无法启动转录，使得开花显著延迟(Cuietal.，2014；Stiefetal.，2014)。由上述研究结果可以看出，植物SBP基因家族参与miR156-SBP通路，将植物适应非生物胁迫和生长发育调控相关联，使得植物灵活调控机体的能量分配倾向于胁迫响应抑或是生长发育。目前，尚未有柽柳属植物的SBP转录因子相关报道，克隆和开发利用柽柳SBP转录因子，不仅有助于阐明盐生植物高度耐盐的分子调节机制，而且可以为筛选重要耐盐基因和抗逆遗传育种提供理论基础和分子工具，对盐碱地利用和农业综合生产能力提高具有重要应用价值。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种柽柳基因TcSBP5，是调控柽柳耐盐性的关键基因。本专利技术的另一目的是提供一种上述调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5的应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。含有所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5的载体。构建植物超表达载体PBI121GW-TcSBP5，组装通路克隆attR1和attR2元件，快速组装TcSBP5基因表达框并确保准确翻译；在TcSBP5基因的5′端组装组成型强表达启动子P35S，使TcSBP5基因在植物体内高效表达，从而调控耐盐性；在TcSBP5基因的3′端组装了强终止子NOS，可有效终止TcSBP5基因的转录；在载体上组装NPTII基因表达盒，作为转基因筛选标记，可以用卡那霉素进行转基因拟南芥的筛选。含有所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5的宿主细胞。所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5在植物耐盐性育种中的应用。有益效果：与现有技术相比，本申请的优点在于：本申请公开了一种调控柽柳盐耐性的关键基因TcSBP5，将TcSBP5基因转入拟南芥，超表达TcSBP5基因的拟南芥其植株耐盐性显著下降，其种子的耐盐萌发率显著下降，说明TcSBP5基因是调控柽柳耐盐性的关键调节因子，可用于土壤盐度指示植物的育种，为柽柳耐盐性的基因表达调控分子机制提供理论研究依据和基因序列，在林木基因工程和耐盐性育种领域有重要应用价值。附图说明图1是植物超表达载体PBI121GW的结构示意图；图2是10株成功转化的转基因拟南芥的TcSBP5插入片段的PCR检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；图3是超表达TcSBP5基因的拟南芥和野生型拟南芥形态比较图：1为转基因拟南芥0.3％NaCl培养基生长28d；2为转基因拟南芥0.3％NaCl培养基生长14天后转入无NaCl的MS培养基脱盐处理14天；3为野生型拟南芥0.3％NaCl培养基生长28d；4为野生型拟南芥0.3％NaCl培养基生长14天后转入无NaCl的MS培养基脱盐处理14天；图4是超表达TcSBP5基因的拟南芥和野生型拟南芥种子萌发率比较图，右为野生型，左为超表达TcSBP5基因的拟南芥。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：通过RACE技术克隆TcSBP5基因基于柽柳RNA-seq数据的TcSBP5序列，设计5′和3′的RACE引物，通过巢式PCR扩增两段特异性产物，通过T-载体克隆测序，测序结果通过重叠区拼接，得到cNDA全长。具体如下：I.引物设计3′RACE正向引物为：OuterPrimerF：InnerPrimerF：3′RACE反向引物为：OuterPrimerR：InnerPrimerR：5′RACE正向引物为OuterPrimerF：InnerPrimerF：5′RACE反向引物为：OuterPrimerR：InnerPrimerR：II.3′RACE反应过程：(1)反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：1μgTotalRNA(植物材料为柽柳叶片)，4μLdNTPMix，2μL3′RACEAdapter，2μL10XRTBuffer，1μLRNaseInhibitor，1μLM-MLVReverseTranscriptase，Nuclease-freeWater补至20μL。(2)轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1小时，进入PCR步骤；(3)3′RACE巢式PCR；3′RA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。3.含有权利要求1所述调控柽柳耐盐性的关键基因TcSBP5的载体。4.根据权利要求3所述载体，其特征在于：所述载体为PBI121GW-TcSBP5。5.根据权利要求4所述载体，其特征在于：所述PBI121GW-TcSBP5含有attR1和at...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥猛，王建文，叶友菊，陈彩慧，樊航，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32