本发明专利技术公开了马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44‑1及应用，StMYB44‑1的基因序列如SEQ IDNO.1所示。植物材料选择；试剂的选择；RNA提取及qPCR；表达载体的构建；根据马铃薯数据库的设计引物，StMYB44‑1基因序列克隆，以cDNA为模板，通过PCR扩增，从马铃薯品种黑美人的薯肉中获得了StMYB44‑1的完整编码序列。本发明专利技术发现了高温下抑制马铃薯块茎花色素苷合成的转录因子StMYB44‑1，本发明专利技术为阐明温度影响下马铃薯块茎花色素苷的调控机制，并以此为基础改良马铃薯花色素苷的含量具有重要的意义。
Transcription Suppressor StMYB44-1 for Anthocyanin Synthesis in Potato Tubers and Its Application
【技术实现步骤摘要】
马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1及应用
本专利技术涉及基因
，具体为马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1及应用。
技术介绍
花色素苷是决定植物颜色的黄酮类物质，对植物生长和人类健康具有重要的作用。花色素苷是植物次生代谢过程中产生的黄酮类物质，是植物中最重要、分布最广泛的一类有色物质，赋予植物各种颜色。它们不仅使植物产生丰富的色彩，还在昆虫的传粉，生长素运输，保护叶片免受紫外线伤害，抑制病虫害等方面有重要的作用。作为天然色素，花色素苷可应用于食品、化妆品等行业，同时它被证明具有抗氧化、抗病毒、延缓机体组织衰老、抑制炎症和过敏、预防心血管疾病、提高人体免疫力、抗癌等作用，其医药价值更是备受关注。MYB类转录因子参与花色素苷合成过程，对植物颜色的形成具有重要作用。大多数的MYB转录因子为转录激活子，也有少数MYB转录因子能够抑制花色素苷的积累(转录抑制子)，但是，对于MYB转录因子调控花色素苷合成的机理认识还非常有限，因此，研究MYB转录激活子和抑制子共同调控花色素苷合成的分子机理具有重要的理论意义。马铃薯(SolanumTuberosumL.)是世界第三大粮食作物，种植潜力大，能够缓解资源环境压力，自身营养价值高，有助于改善和丰富居民膳食营养结构，马铃薯也是甘肃省第三大经济作物，是甘肃农业经济发展的重要支柱产业。马铃薯具有非常丰富的种质资源，其薯肉和薯皮具有白、红、紫等一系列色泽。彩色马铃薯不仅外形美观，而且富含花色素苷，与其他色素源作物相比具有明显的发展优势：种植成本低，对环境适应能力强，食用方便，易于生产和加工，长时间贮藏后色素含量无明显下降，具有较高的块茎产量。同时四倍体彩色马铃薯所含色素主要是酰基化花色素苷，其提取物较葡萄、紫胡萝卜等的色素提取物具有更好的稳定性和抗氧化活性，因此，马铃薯是获得优质花色素苷的理想来源，并可作为新颖的自然着色剂和抗氧化剂资源，广泛应用于食品工业和医药研究。目前对于MYB转录因子调控花色素苷合成的机理认识还非常有限，尤其是马铃薯块茎花色素苷合成的抑制转录因子还未被发掘。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1及应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1，其基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的制备方法包含以下步骤：步骤一、植物材料选择，选择四倍体紫色马铃薯品种“黑美人”种植于20cm直径的花盆中，培养于21/17℃(昼/夜)的光照培养箱中，光照强度为200μmolm-2·s-116小时以及8小时黑暗培养。植株生长一个月后，将植株转移至26/22℃(昼/夜)的光照培养箱中，对照仍在21/17℃的光照培养箱中继续培养。待块茎成熟后，每个处理下的取六个新鲜块茎，用手术刀小心地取皮，并将薯肉切成小块，将皮和肉立即在液氮中冷冻并放置在-80℃冰箱中。步骤二试剂的选择，大肠杆菌DH5α感受态细胞、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶均购自TaKaRa公司；PureLinkPlantRNAReagentKit购自美国Invitrogen生命技术有限公司；其中QuantiTectReverseTranscriptionKit购自Qiagen公司；DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根公司；其他生化试剂均为国产分析纯；步骤三、RNA提取及qPCR，用PureLinkPlantRNAReagentKit试剂盒分别抽提马铃薯薯皮薯肉的总RNA，通过使用NanodropND-1000分光光度计，测定RNA纯度和浓度，并用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，利用QuantiTectReverseTranscriptionKit试剂盒进行反转录，其中以Oligo(dT)20为引物,下合成cDNA第一链，并在-20℃下保存；其中qPCR反应体系为95℃预变性30s、95℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，内参基因为StEF-1α(AB061263)，相对表达量用Ct(2-ΔΔCt)方法测定，引物为StMYB44-1qF5’-GTGATTCCAGTCTTTCGGGTTTTCC-3；StMYB44-1qR5’-AGGAGGAAGAGGGAAAATCCCG-3；步骤四、表达载体的构建，根据马铃薯数据库的PGSC0003DMG400003316设计引物根据序列设计引物克隆StMYB44-1的全长编码序列，通过使用In-FusionHD克隆试剂盒(ClontechLaboratories，Inc.，MountainView，CA)将具有EcoRI和HindIII限制性位点的PCR产物克隆到二元载体pSAK277的多克隆位点(MCS)中；步骤五、StMYB44-1基因序列克隆，以cDNA为模板，通过PCR扩增，从马铃薯品种黑美人的薯肉中获得了长度为954bp的StMYB44-1的完整编码序列。马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的应用，高温条件下，在马铃薯黑美人品种的白肉中高表达，在高温或对照下的紫色薯皮和薯肉中表达较低，因此StMYB44-1对花色素苷生物合成具有一定的抑制效果。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术发现了高温下抑制马铃薯块茎花色素苷合成的转录因子StMYB44-1，本专利技术为阐明温度影响下马铃薯块茎花色素苷的调控机制，并以此为基础改良马铃薯花色素苷的含量具有重要的意义。附图说明图1为不同温度处理下薯块表型及花色素苷含量图；图2为StMYB44-1，StMYB44-2，AtMYB44以及和其它类黄酮合成相关抑制子氨基酸序列比对图；图3为StMYB44-1和StMYB44-2在白色薯肉中高表达图；图4为StMYB44-1和StMYB44-2转录因子的功能验证图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例：马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的制备方法为：1、材料与方法1.1植物材料和生长条件四倍体紫色马铃薯栽培品种“黑美人”(HM，紫色皮和紫色果肉)种植于20cm直径的花盆中，培养于21/17℃(昼/夜)的光照培养箱中，光照强度为200μmolm-2·s-116小时以及8小时黑暗培养。植株生长一个月后，将植株转移至26/22℃(昼/夜)的光照培养箱中，对照仍在21/17℃的光照培养箱中继续培养。待块茎成熟后，每个处理下的取六个新鲜块茎，用手术刀小心地取皮，并将薯肉切成小块，将皮和肉立即在液氮中冷冻并放置在-80℃冰箱中。1.2试剂大肠杆菌DH5α感受态细胞、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶均购自TaKaRa公司；PureLinkPlantRNAReagentKit购自美国Invitrogen生命技术有限公司；QuantiTectRev本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44‑1，其特征在于：StMYB44‑1的基因序列如SEQ IDNO.1所示。
【技术特征摘要】
1.马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1，其特征在于：StMYB44-1的基因序列如SEQIDNO.1所示。2.马铃薯块茎花色素苷合成转录抑制子StMYB44-1的制备方法，其特征在于：制备方法包含以下步骤：步骤一、植物材料选择，选择四倍体紫色马铃薯品种“黑美人”种植于20cm直径的花盆中，培养于21/17℃(昼/夜)的光照培养箱中，光照强度为200μmolm-2·s-116小时以及8小时黑暗培养。植株生长一个月后，将植株转移至26/22℃(昼/夜)的光照培养箱中，对照仍在21/17℃的光照培养箱中继续培养，待块茎成熟后，取六个新鲜块茎，用手术刀小心地取皮，并将薯肉切成小块，将皮和肉立即在液氮中冷冻并放置在-80℃冰箱中；步骤二试剂的选择，大肠杆菌DH5α感受态细胞、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶均购自TaKaRa公司；PureLinkPlantRNAReagentKit购自美国Invitrogen生命技术有限公司；其中QuantiTectReverseTranscriptionKit购自Qiagen公司；DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根公司；其他生化试剂均为国产分析纯；步骤三、RNA提取及qPCR，用PureLinkPlantRNAReagentKit试剂盒分别抽提马铃薯薯皮薯肉的总RNA，通过使用NanodropND-1000分光光度计，测定RNA纯度和浓度，并用1％琼脂糖凝胶电...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉汇，李元铭，王丽，张俊莲，刘震，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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