准确鉴别缺失突变纯、杂合线虫的三引物组及PCR鉴别方法技术

本发明专利技术提供了准确鉴别缺失突变纯、杂合型线虫的三引物组及PCR鉴别方法，属于基因编辑技术领域，更具体地涉及一种准确鉴别缺失突变纯、杂合型线虫的三引物组及PCR鉴别方法。通过设计上游引物D‑S、下游引物D‑A和第三引物WT‑S，并将该三引物组用于缺失突变纯、杂合型线虫的PCR鉴定中，对野生型、缺失突变型DNA模板，进行竞争性PCR，很好地解决了由上游引物D‑S和下游引物D‑A组成的二引物组PCR导致的假阳性结果和鉴别效率低的问题，更准确地鉴别出野生型、缺失突变杂合型及缺失突变纯合型线虫。类推，也可以通过设计上游引物D‑S、下游引物D‑A和第三引物WT‑A，组成三引物组对缺失突变纯、杂合型线虫进行鉴定。此鉴别方法可以广泛用于其他物种中删除型突变体的鉴定。

【技术实现步骤摘要】
准确鉴别缺失突变纯、杂合线虫的三引物组及PCR鉴别方法
本专利技术属于缺失突变基因型鉴定
，更具体地涉及准确鉴别缺失突变纯、杂合线虫的三引物组及PCR鉴别方法，本专利技术也可以用于其他物种基因组中基因缺失突变体的快速鉴定。
技术介绍
通过减弱或敲除基因的方法达到降低或阻止基因表达，使基因沉默，是经典的反向遗传学研究手段之一。我们可以通过研究基因表达减弱或敲除后的表型变化，推测基因的相关功能。之后将该基因与生物体整体的功能相关联来进行更加深入的研究，也为最终确定基因功能提供相关依据。随着功能基因组学的不断深入研究，相关技术也得到不同程度的发展与完善，其中最为常用的技术便是基因敲除技术。目前，线虫作为一种经典的遗传学模式生物，由于具有生命周期短、基因组小、基因数目多、便于遗传操作、通体透明易于显微观察等优势，被国内外众多的科研机构作为研究材料，在衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现，线虫中大约有40-60％的基因是在人体中具有等同作用，并且有许多重要的保守的人类遗传疾病同源基因。所以，从理论上讲，只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的，就可能利用模式生物来进行研究。当线虫基因组一个基因被删除序列的长度比较大(如大于50bp)时，可以通过比较序列删除前后PCR扩增片段大小区分野生型、缺失突变杂合型和缺失突变纯合型。通常采用的是二引物组鉴别法，即在被删除序列的上下游各设一条引物组成一个引物对。分别以野生型、缺失突变杂合型和缺失突变纯合型线虫DNA为模板进行特异性扩增，之后进行普通的琼脂糖凝胶电泳进行结果检测，再结合测序结果分析即可。但在实践中，杂合模板中包含了缺失突变型和野生型两种模板，以缺失突变型为模板需扩增片段长度短，而以野生型为模板需扩增片段长度长。在PCR聚合酶链式反应的延伸步骤中，长片段的延伸效率大大低于短片段的延伸效率，因此当利用传统二引物组扩增法鉴定杂合模板时，混合模板中的野生型模板中的扩增因为扩增长度长而被抑制，扩增产物中主要为扩增缺失突变型模板得到的短片段。此时，杂合线虫模板很容易被鉴定成纯合缺失突变型，导致假阳性情况的发生。缺失片段长度越大，假阳性发生概率越高。请参阅图1，图中显示了二引物组扩增鉴定法中的两条引物在野生型模板上的结合位点示意图。图中深灰色部分所示为在缺失突变中被删除的序列，长度为800bp，图中所示浅灰色部分为在缺失突变中仍保留的序列，在被删除序列的上游500bp和下游500bp的位置分别设置上游引物D-S和下游引物D-A，组成引物对。当使用这样的二引物组进行纯合杂合线虫基因型鉴定时，如图1所示，以野生型线虫为模板，PCR产物长度为1800bp，以纯合缺失突变为模板，PCR产物长度为1000bp，以杂合突变线虫为模板，理论上PCR产物的长度有两种，分别为1800bp和1000bp，但是因为1800bp扩增产物被1000bp扩增产物竞争抑制，得到的PCR产物为1000bp。因为PCR产物长度为1000bp，这样很容易将杂合缺失突变体当成了纯合缺失突变体，杂合和纯合模板不能被很好地区分即导致了假阳性的出现。假阳性结果会干扰缺失突变纯合体的获得，一旦出现误把杂合型当成纯合型，线虫繁殖一至两代后，缺失突变型线虫会越来越少，直至消失，这样很容易导致丢失来之不易的缺失突变型线虫株。因此避免纯合突变型线虫假阳性的出现至关重要。
技术实现思路
为此，需要提供一种能准确鉴别缺失突变纯、杂合线虫的三引物组及其PCR鉴别方法以解决鉴别缺失突变纯、杂合线虫时出现假阳性等鉴别结果不准确和鉴别效率低下的问题。为实现上述目的，专利技术人提供了准确鉴别缺失突变纯、杂合线虫的三引物组，所述三引物组由上游引物D-S、下游引物D-A和第三引物WT-S组成。进一步地，所述上游引物D-S设置在所述缺失突变的5’上游200bp-700bp位置，所述下游引物D-A设置在所述缺失突变的3’下游200bp-700bp的位置，所述第三引物WT-S设置在所述缺失突变被删除的序列上。进一步地，所述上游引物D-S与下游引物D-A以及所述第三引物WT-S与下游引物D-A的G、C碱基百分比相差不超过10％，总碱基个数相差不超过2个碱基，且无引物间二聚体。进一步地，所述上游引物D-S和下游引物D-A组成第一引物对，所述第三引物WT-S和下游引物D-A组成第二引物对，所述第一引物对和第二引物对的退火温度相同。进一步地，所述第一引物对扩增缺失突变模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp，所述第二引物对扩增缺失突变模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp。进一步地，所述第一引物对扩增缺失突变模板DNA后得到的片段比第二引物对扩增野生型模板DNA后得到的片段长100bp-350bp。本专利技术还提供了三引物组用于缺失突变纯、杂合线虫的PCR鉴别方法，包括以下步骤：引物设计：利用primer5软件或oligo6等引物设计软件进行三引物设计，所述三引物为权利要求1-6中任一项所述的上游引物D-S、下游引物D-A和第三引物WT-S，所述上游引物D-S和下游引物D-A组成第一引物对，所述第三引物WT-S和下游引物D-A组成第二引物对；获取需要鉴定的线虫DNA模板；确定最适退火温度：以野生型线虫为模板，分别使用所述第一引物对和第二引物对，进行温度梯度PCR，寻找两个引物对都能PCR扩增出条带正确且亮度合适的退火温度；三引物组PCR：将所述上游引物D-S、下游引物D-A和第三引物WT-S同时加入PCR混合液中，作用于所述需要鉴定的线虫DNA模板进行竞争性PCR，得到PCR产物；将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析谱图，得出结果。进一步地，所述三引物组PCR步骤中用的PCR体系为：10xpfu扩增缓冲液，1μL；浓度为10mM的dNTP，0.2μL；Pfu高保真酶，0.5μL；浓度为100μM的所述上游引物D-S，0.05μL；浓度为100μM的所述下游引物D-A，0.05μL；浓度为100μM的所述第三引物WT-S，0.05μL；需要鉴定的线虫DNA模板，0.5μL；重蒸馏水，7.65μL。进一步地，所述三引物组PCR步骤中的工艺条件为：94℃1min30s；94℃20s；最适退火温度20s；72℃1min，以上三个步骤30个循环；72℃5min；18℃保存。区别于现有技术，上述技术方案在二引物组PCR鉴别缺失突变纯、杂合线虫的基础上，设计了一个能与下游引物D-A引物配对的第三引物WT-S。如图2所示，第三引物WT-S可以退火结合在被删除的核苷酸序列上，因此第三引物WT-S与下游引物D-A组成的第二引物对能以野生型线虫为模板，扩增出相应大小的片段。图2为本专利技术具体实施方式所述三引物组鉴别WT缺失突变纯、杂合型线虫的PCR方法示意图。如图2所示，第三引物WT-S结合在距删除序列3’端300bp的位置，因此第三引物WT-S与下游引物D-A组成的第二引物对能以野生型为模板，扩增出800bp的条带。虽然野生型模板也能被上游引物D-S和下游引物D-A组成的第一引物对结合并扩增出1800bp的条带，但是因为扩增长度长，竞争不过第三引物WT-S和下游引物D-A组成的第二引物对的扩增效率，得到的终产物主要为长度800bp的条带。对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.准确鉴别缺失突变纯、杂合线虫的三引物组，其特征在于，所述三引物组由上游引物D‑S、下游引物D‑A和第三引物WT‑S组成。

【技术特征摘要】
1.准确鉴别缺失突变纯、杂合线虫的三引物组，其特征在于，所述三引物组由上游引物D-S、下游引物D-A和第三引物WT-S组成。2.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物D-S设置在所述缺失突变的5’上游200bp-700bp位置，所述下游引物D-A设置在所述缺失突变的3’下游200bp-700bp的位置，所述第三引物WT-S设置在所述缺失突变被删除的序列上。3.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物D-S与下游引物D-A以及所述第三引物WT-S与下游引物D-A的G、C碱基百分比相差不超过10％，总碱基个数相差不超过2个碱基，且无引物间二聚体。4.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述上游引物D-S和下游引物D-A组成第一引物对，所述第三引物WT-S和下游引物D-A组成第二引物对，所述第一引物对和第二引物对的退火温度相同。5.根据权利要求1所述的三引物组，其特征在于，所述第一引物对扩增缺失突变模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp，所述第二引物对扩增缺失突变模板DNA后得到的片段大小为600-1200bp。6.根据权利要求5所述的三引物组，其特征在于，所述第一引物对扩增缺失突变模板DNA后得到的片段比第二引物对扩增野生型模板DNA后得到的片段长100bp-350bp。7.三引物组用于缺失突变纯、杂合线虫的PCR鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：引物设计：利用引物设计软件...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵培，康雅虹，廖加磊，
申请(专利权)人：苏州上源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32