一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6-sgRNA质粒的方法技术

本发明专利技术属于线虫基因编辑技术领域，更具体地说是一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6‑sgRNA质粒的方法，通过改造秀丽线虫pU6‑unc‑119sgRNA原始载体，构建pU6‑2X BseRI‑sgRNA质粒，用BseRI酶切pU6‑2X BseRI‑sgRNA质粒得到带有粘性末端的载体，将包含了sgRNA靶序列及粘性末端的正反引物通过退火形成带有粘性末端的sgRNA靶DNA小片段，在T4DNA连接酶的作用下，载体与带有相匹配的粘性末端的sgRNA靶DNA小片段连接，转化DH5α感受态细胞，从转化后的大肠杆菌中筛选阳性单克隆，并测序验证sgRNA靶序列是否正确。使用该技术方案，构建周期不到1天，T4DNA酶连之前的工作耗时不到半个小时，比常规方法的纯人工耗时减少至少4个小时，构建周期减少2天。构建一个sgRNA质粒只需合成包含44个碱基的两条引物，大大减少了构建成本。

A Rapid Construction Method of pU6-sgRNA Plasmid for Nematode Gene Editing

The invention belongs to the technical field of nematode gene editing, and more specifically is a method for rapidly constructing the pU6 sgRNA plasmid for the purpose of nematode gene editing. By modifying the original vector of nematode pU6 UNC 119;sgRNA, the pU6 2X BseRI sgRNA plasmid is constructed, and the vector with viscous ends is obtained by cutting pU6 2X BRI sgRNA plasmid with BseRI enzyme, which will contain sgRNA target sequence. The positive and negative primers of column and viscous end were annealed to form small fragments of sgRNA target DNA with viscous end. Under the action of T4DNA ligase, the vector was connected with small fragments of sgRNA target DNA with matching viscous end, transformed into DH5alpha competent cells, screened positive monoclones from transformed Escherichia coli, and sequenced to verify whether the target sequence of sgRNA was correct. Using this technology, the construction cycle is less than 1 day, and the work before T4 DNA enzyme ligation takes less than half an hour, which is at least 4 hours less than the pure manual time of conventional methods, and 2 days less than the construction cycle. To construct a sgRNA plasmid, only two primers containing 44 bases need to be synthesized, which greatly reduces the cost of construction.

【技术实现步骤摘要】
一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6-sgRNA质粒的方法
本专利技术属于线虫基因编辑
，更具体地说是一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6-sgRNA质粒的方法。
技术介绍
在考虑到经济成本和工作量的情况下，如今大多数线虫实验室很少通过注射Cas9蛋白和转录好的sgRNA(singleguideRNA简称)进行基因编辑，而是多通过直接注射编码Cas9和sgRNA质粒的方法来改造基因组。CRISPR/Cas9基因编辑系统最为关键的是寻找到合适的sgRNA靶位点，一方面需要sgRNA靶位点没有脱靶效应，另一方面需要sgRNA靶位点被sgRNA-Cas9二元复合物识别后能与Cas9稳定结合，并被Cas9蛋白酶切形成双链DNA切口。sgRNA在这两个关键步骤发挥了重要的作用。早先发现的引导RNA，由两部分组成即tracRNA和crRNA，两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使引导的功能，与Cas9蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。目前工程化的sgRNA/Cas9系统中的sgRNA由两部分组成，即sgRNA靶位点识别序列和sgRNA骨架序列。sgRNA靶位点序列是原始间隔序列相邻基序PAM(5’-NGG-3’)上游的20bp序列，由G/A(N)19组成，其中G/A(N)19代表识别的sgRNA靶位点序列。如图1所示pU6-unc-119sgRNA质粒为例，线虫中常用的sgRNA质粒包含将近500bp的U6snRNA启动子，其后紧接sgRNA靶位点识别序列和sgRNA骨架序列以及将近300bp的U6snRNA下游序列。对于不同位点的基因编辑，sgRNA骨架序列是相同的，而sgRNA靶位点识别序列不同。目前较多使用两步PCR方法构建线虫sgRNA质粒，FriedlandAE1，TzurYB，EsveltKM，ColaiácovoMP，ChurchGM，CalarcoJA等人在“HeritablegenomeeditinginC.elegansviaaCRISPR-Cas9system”中公开了通过两步PCR方法(见图2)将如图1所示EcoRI和HindIII酶切位点之间的序列(包括U6启动子、新的sgRNA靶位点识别序列、sgRNA骨架序列和U6snRNA下游序列)进行替换，构建带有新的sgRNA靶位点序列的质粒。FarboudB、MeyerBJ在“DramaticEnhancementofGenomeEditingbyCRISPR/Cas9ThroughImprovedGuideRNADesign”中公开了通过Gibson组装的方法将EcoRI和HindIII酶切位点之间的序列进行替换。ArribereJA、BellRT、FuBXH等人在“EfficientMarker-FreeRecoveryofCustomGeneticModificationswithCRISPR/Cas9inCaenorhabditiselegans”中公开了通过将包含sgRNA靶位点序列的互补引物与BsaI酶切后的pRB1017载体连接，构建包含新sgRNA靶位点序列的sgRNA质粒。目前很多实验室仍旧使用上述第一、二种方法构建pU6-sgRNA质粒，这两种方法的缺陷在于都需要设计多对引物进行PCR扩增，获得含有目的pU6-sgRNA靶序列的条带，并利用限制性酶切位点进行酶切、酶连等一系列繁琐流程，用时长、引物条数多，引物较长，且易错率高。从Addgene数据库中改质粒被购买的次数可知，第三种方法中使用的载体并没被普遍使用，同时也因为pRB1017载体使用R07E5.16snRNA启动子，因此需要建立以pU6-sgRNA为基础的快速sgRNA质粒构建方法。pRB1017载体经过BsaI酶切后，带有3’-AGAA-5’和5’-GTTT-3’粘性末端，需要合成的两个引物分别需要带有5’-TCTT-3’和3’-CAAA-5’粘性末端。因此每个sgRNA质粒的构建过程中，需要额外合成粘性末端8bp。在实际应用中，需要构建的sgRNA质粒个数非常多，因此，寻找一种新的减少合成引物中粘性末端序列长度构建方法势在必行。
技术实现思路
为此，需要建立一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6-sgRNA质粒的方法，以解决传统方法中使用引物条数多、引物较长、流程繁琐、用时长且易错率高的技术问题。为实现上述目的，专利技术人提供了一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6-sgRNA质粒的方法，包括以下步骤：构建pU6-2XBseRI-sgRNA质粒：以pU6-unc-119sgRNA为原始载体，在U6启动子和sgRNA骨架序列之间插入两个相向的BseRI酶切位点，得到pU6-2XBseRI-sgRNA质粒；BseRI酶切改造后的载体：BseRI酶切所述pU6-2XBseRI-sgRNA质粒，得到带有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的载体，胶回收备用；合成引物：合成包含sgRNA靶位点序列的正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的末端带有与所述带有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的载体的黏性末端相匹配的碱基；退火：将所述正向引物和反向引物退火，得到带有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段；酶连：在T4DNA连接酶的作用下，将所述带有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段与带有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的载体进行连接，得到酶连产物；转化：将所述酶连产物转化到DH5α感受态细胞；挑单克隆、PCR筛选阳性菌、阳性菌测序、比对序列，提取所述带有sgRNA靶位点序列的pU6-sgRNA质粒。进一步地，所述pU6-2XBseRI-sgRNA质粒的碱基序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述BseRI酶切改造后的载体步骤中用的酶切体系为：所述pU6-2XBseRI-sgRNA质粒2ug，4μL；10xCutsmart酶切缓冲液，10μL；BseRI酶，2μL；重蒸馏水，84μL。进一步地，所述BseRI酶切改造后的载体步骤为：将所述酶切体系置于PCR管中混合，于37℃酶切消化1h后，不进行碱性磷酸酶处理，直接于80℃热激处理终止酶切反应，得到酶切产物，将所述酶切产物跑1％凝胶电泳，回收3461bp片段进行纯化，得到所述带有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的载体。进一步地，所述正向引物和反向引物分别为sg-F：5'-N20GT-3'，其中N20表示PAM序列5’-NGG-3’上游20bpsgRNA靶位点序列；sg-R：5'-n20AA-3'，其中n20表示N20序列反向互补后的序列。进一步地，所述退火步骤中用的退火体系为：浓度为100μM的所述正向引物sg-F，1μL；浓度为100μM的所述反向引物sg-R，1μL；重蒸馏水，8μL。进一步地，所述退火步骤中用的退火程序为：95℃10min；85℃1min；75℃1min；65℃1min；55℃1min；45℃1min；35℃1min；25℃1min；15℃保存。进一步地，所述酶连步骤中用的酶连体系为：所述带有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段用重蒸馏水稀释200倍的溶液，1.0μL；所述带有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6‑sgRNA质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建pU6‑2XBseRI‑sgRNA质粒：以pU6‑unc‑119 sgRNA为原始载体，在U6启动子和sgRNA骨架序列之间插入两个相向的BseRI酶切位点，得到pU6‑2XBseRI‑sgRNA质粒；BseRI酶切改造后的载体：BseRI酶切所述pU6‑2XBseRI‑sgRNA质粒，得到带有3’‑CA‑5’和5’‑TT‑3’黏性末端的载体，胶回收备用；合成引物：合成包含sgRNA靶位点序列的正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的末端带有与所述带有3’‑CA‑5’和5’‑TT‑3’黏性末端的载体的黏性末端相匹配的碱基；退火：将所述正向引物和反向引物退火，得到带有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段；酶连：在T4DNA连接酶的作用下，将所述带有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段与带有3’‑CA‑5’和5’‑TT‑3’黏性末端的载体进行连接，得到酶连产物；转化：将所述酶连产物转化到DH5α感受态细胞；挑单克隆、PCR筛选阳性菌、阳性菌测序、比对序列，提取所述带有sgRNA靶位点序列的pU6‑sgRNA质粒。...

【技术特征摘要】
1.一种快速构建秀丽线虫基因编辑所需目的pU6-sgRNA质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：构建pU6-2XBseRI-sgRNA质粒：以pU6-unc-119sgRNA为原始载体，在U6启动子和sgRNA骨架序列之间插入两个相向的BseRI酶切位点，得到pU6-2XBseRI-sgRNA质粒；BseRI酶切改造后的载体：BseRI酶切所述pU6-2XBseRI-sgRNA质粒，得到带有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的载体，胶回收备用；合成引物：合成包含sgRNA靶位点序列的正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的末端带有与所述带有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的载体的黏性末端相匹配的碱基；退火：将所述正向引物和反向引物退火，得到带有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段；酶连：在T4DNA连接酶的作用下，将所述带有黏性末端的sgRNA靶DNA小片段与带有3’-CA-5’和5’-TT-3’黏性末端的载体进行连接，得到酶连产物；转化：将所述酶连产物转化到DH5α感受态细胞；挑单克隆、PCR筛选阳性菌、阳性菌测序、比对序列，提取所述带有sgRNA靶位点序列的pU6-sgRNA质粒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pU6-2XBseRI-sgRNA质粒的碱基序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BseRI酶切改造后的载体步骤中用的酶切体系为：所述pU6-2XBseRI-sgRNA质粒2ug，4μL；10xCutsmart酶切缓冲液，10μL；BseRI酶，2μL；重蒸馏水，84μL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述BseRI酶切改造后的载体步骤为：将所述酶切体系置于PCR管中混合，于37℃酶切...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵培，康雅虹，谢喜珍，
申请(专利权)人：苏州上源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32