多靶点编辑载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种多靶点编辑载体，包括Cpfl蛋白表达元件和至少两个sgRNA转录元件。多靶点编辑载体通过共表达Cpfl蛋白与多个sgRNA，实现了对基因组不同靶位点的同时编辑，提高了基因编辑的效率，降低了基因编辑的脱靶效应，提高了基因编辑的精确度。本发明专利技术还公开了一种上述多靶点编辑载体的构建方法，通过两步Golden Gate克隆将多个sgRNA顺次串联至到带有Cpfl蛋白表达元件和荧光表达元件的第二载体，得到上述的多靶点编辑载体。上述构建方法步骤简单，简化了实验设计过程，降低了基因编辑的成本。本发明专利技术还公开了包括上述多靶位点载体的试剂盒，能够用于高效率和低脱靶的多靶点的共同编辑。

Multi-Target Editing Vector and Its Construction Method and Application

The invention discloses a multi-target editing vector, comprising a Cpfl protein expression element and at least two sgRNA transcription elements. By co-expressing Cpfl protein and sgRNA, multi-target editing vectors realize simultaneous editing of different genome targets, improve the efficiency of gene editing, reduce the Miss effect of gene editing and improve the accuracy of gene editing. The invention also discloses a construction method of the above multi-target editing vector. The above multi-target editing vector is obtained by sequentially connecting multiple sgRNA to a second vector with Cpfl protein expression element and fluorescent expression element through two-step Golden Gate cloning. The above construction method is simple, simplifies the experimental design process and reduces the cost of gene editing. The invention also discloses a kit comprising the multi-target site carrier, which can be used for co-editing of multi-target points with high efficiency and low miss.

【技术实现步骤摘要】
多靶点编辑载体及其构建方法和应用
本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种多靶点编辑载体及其构建方法和应用。
技术介绍
基因编辑技术是一种可以对基因组或转录产物进行精确修饰的技术，可完成基因定点突变、片段的敲除或敲入等。在后基因组时代，基因编辑技术已成为生命科学领域的重要研究内容。传统的基因编辑技术以胚胎干细胞和基因重组为基础进行生物基因组定向修饰，但是该技术存在打靶效率低，实验周期长及应用范围窄等缺点。随着基因编辑技术的不断发展，人工核酸酶介导的基因编辑技术开始被广泛应用，该技术通过特异性地识别并裂解靶DNA双链，激发细胞内源性的修复机制实现基因定向改造，与传统基因编辑技术相比，基因编辑新技术打靶效率高、构建成本低、应用范围广，极大地促进了生命科学和医学领域的研究进程。目前基因组编辑新技术主要包括以下几种：人工核酶介导的锌指核酸酶(Zincfingernucleases，ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectorsnuclease，TALEN)技术、成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-associatedprotein-9nuclease，CRISPR/Cas9)技术、CRISPR/Cpf1技术以及结构引导的核酸酶(Structure-guidednuclease，SGN)技术。使用CRISPR做基因敲除非常快捷有效，天然的Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个内切酶功能域，当提供正确的sgRNA靶向时，可以造成目标序列的双链DNA断裂，依赖于细胞的同源重组和非同源末端连接的修复机制，切断的DNA可以进行再连接。依靠非同源末端连接修复途径容易造成数个碱基的插入和缺失，因此可以造成编码基因的读码框发生改变。当提供两条sgRNA时，可以实现将这两个sgRNA靶向位点之间的序列删除，可以用于敲除非编码序列。当给细胞提供与断点两端同源的模板时，依靠细胞同源重组的修复途径，可以使目标序列发生替换，实现一段DNA序列的靶向插入。虽然CRISPR系统的扩展性好，可以针对不同的序列设计不同的sgRNA实现基因组编辑、基因表达调控，以及染色质标记功能，但是在同一个细胞中并行完成多个序列的同时靶向功能仍然具有挑战性。现有的CRISPR系统难以并行的主要原因是多条sgRNA导入同一细胞难以实现。通过质粒的瞬时转染办法，很难将多个质粒均匀导入细胞。传统方法同时导入多个DNA片段进入细胞有显微注射和病毒感染。显微注射需要特殊的仪器，且操作通量低，对于需要大量细胞的实验无法使用。通过病毒感染对操作者的技术要求较高，同时具有一定的危险性，且病毒感染也具有一定程度的随机性和异质性，无法完全保证所有的DNA会进入同一个细胞。CRISPR/Cas9基因编辑系统的特异性决定于sgRNA上的识别序列(～20nt)。然而，在复杂的生物基因组中，sgRNA的识别序列可能会与非靶点DNA发生局部匹配，导致CRISPR/Cas9系统的高脱靶效应(Off-targeteffects)，严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。中国专利文献CN106520824A中公开了一种多靶点编辑系统，将Csy4蛋白及其对应识别序列应用于CRISPR/Cas9系统中。具体通过将两个或两个以上的sgRNA串联在一个表达盒中，每个sgRNA的首端和前一个sgRNA的尾端由Csy4切割识别序列连接，利用Csy4蛋白能够切割并识别对应的RNA序列，使得多个sgRNA在同一个表达盒中同时转录后，可以被切割成独立的片段，实现对基因组的多靶点编辑。上述多靶点编辑系统虽然通过将多个sgRNA压缩在一个载体上实现了对基因组多位点的编辑，但多靶点编辑系统在应用时，需要分别构建表达Csy4-Cas9核苷酸序列的重组表达剪刀载体，以及能够转录靶向不同位点的sgRNA的靶点载体，剪刀载体需要同时表达Csy4和Cas9两种蛋白序列，显著增加了载体的大小，降低了载体的转染效率，增加了基因编辑的难度；另一方面，应用上述多靶点编辑系统需要同时共转染剪刀载体和靶点载体，相对于单一载体转染，其转染效率受到限制，并且难以保障两种载体转染以稳定比例转入目标细胞，不仅降低了基因编辑的效率，同时增加了实验成本和实验操作步骤；最后，以CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，易产生脱靶效应，导致基因编辑的精确度低。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中用于基因编辑的多靶点编辑系统存在的基因编辑难度高、基因编辑效率有限、易产生脱靶效应，以及实验成本高和实验操作步骤繁琐的问题；从而提供一种能够显著降低基因编辑的脱靶效应、提高基因编辑效率且简化了实验操作步骤的CRISPR/Cpfl多靶点编辑载体及其构建方法和应用。本专利技术提供了一种多靶点编辑载体，包括Cpfl蛋白表达元件和至少两个sgRNA转录元件。所述的多靶点编辑载体，还包括荧光表达元件。所述的多靶点编辑载体，所述荧光表达元件为EGFP编码基因。所述的多靶点编辑载体，所述Cpfl蛋白表达元件是以人和小鼠的偏好密码子优化后的Cpfl蛋白编码基因。所述的多靶点编辑载体，所述Cpfl蛋白选自AsCpf1蛋白或LbCpf1蛋白。所述的多靶点编辑载体，所述AsCpf1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述LbCpf1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的多靶点编辑载体，所述sgRNA转录元件包括由5’端至3’端顺次连接的U6启动子和crRNA序列，所述crRNA序列包括5’端至3’端顺次连接的sgRNA序列和同向重复序列，所述同向重复序列为Cpf1蛋白的识别和结合序列。本专利技术提供了一种所述的多靶点编辑载体的构建方法，包括以下步骤：(1)在基因组上确定至少两个目标靶点或靶标基因，在所述目标靶点或靶标基因的两侧找到Cpfl蛋白识别的PAM位点，依据所述PAM位点设计sgRNA序列；(2)针对所述sgRNA序列设计靶向配对引物，将所述靶向配对引物退火合成靶向短片段，利用GoldenGate克隆法将所述靶向短片段分别连接至带有U6启动子和同向重复序列的第一载体，得到至少两个中间载体，其中每个所述中间载体包括由5’端至3’端顺次连接的U6启动子、sgRNA序列和同向重复序列；(3)利用GoldenGate克隆法将所述中间载体的sgRNA转录元件连接至带有Cpfl蛋白表达元件和荧光表达元件的第二载体，得到所述多靶点编辑载体。所述的多靶点编辑载体的构建方法，所述第一载体选自pUC57-AsCpf1、pUC57-LbCpf1、pEGFP-N1-AsCpf1和pEGFP-N1-LbCpf1中的至少一种；所述第二载体选自pEGFP-N1-AsCpf1、pEGFP-N1-LbCpf1或者以pEGFP-N1-AsCpf1或pEGFP-N1-LbCpf1作为第一载体构建的中间载体。所述的多靶点编辑载体的构建方法，所述pEGFP-N1-AsCpf1包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的AsCpf1蛋白编码基因；所述pEGFP-N1-LbCpf1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多靶点编辑载体，其特征在于，包括Cpfl蛋白表达元件和至少两个sgRNA转录元件。

【技术特征摘要】
2017.08.31 CN 20171077427731.一种多靶点编辑载体，其特征在于，包括Cpfl蛋白表达元件和至少两个sgRNA转录元件。2.根据权利要求1所述的多靶点编辑载体，其特征在于，还包括荧光表达元件。3.根据权利要求2所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述荧光表达元件为EGFP编码基因。4.根据权利要求1-3任一项所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述Cpfl蛋白表达元件是以人和小鼠的偏好密码子优化后的Cpfl蛋白编码基因。5.根据权利要求4所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述Cpfl蛋白选自AsCpf1蛋白或LbCpf1蛋白。6.根据权利要求5所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述AsCpf1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述LbCpf1蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。7.根据权利要求1-6任一项所述的多靶点编辑载体，其特征在于，所述sgRNA转录元件包括由5’端至3’端顺次连接的U6启动子和crRNA序列，所述crRNA序列包括5’端至3’端顺次连接的sgRNA序列和同向重复序列，所述同向重复序列为Cpf1蛋白的识别和结合序列。8.一种权利要求1-7任一项所述的多靶点编辑载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在基因组上确定至少两个目标靶点或靶标基因，在所述目标靶点或靶标基因的两侧找到Cpfl蛋白识别的PAM位点，依据所述PAM位点设计sgRNA序列；(2)针对所述sgRNA序列设计靶向配对引物，将所述靶向配对引物退火合成靶向短片段，利用GoldenGate克隆法将所述靶向短片段分别连接至带有U6启动子和同向重复序列的第一载体，得到至少两个中间...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗凤鹏，曹青，吴昕，廖国娟，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32