一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法及其产品和应用技术

本发明专利技术提供了一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法及其产品和应用，所述方法包括：采用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除宿主大肠杆菌的基因组中的两段DNA序列，所述DNA序列包括：recA<supgt;+</supgt;基因编码序列和recF<supgt;+</supgt;基因编码序列；所述recA<supgt;+</supgt;基因编码序列5’端至3’端的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述recF<supgt;+</supgt;基因编码序列5’端至3’端的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。采用上述方法制备的大肠杆菌工程菌株生产质粒时，能显著减少质粒聚体的产生，提高质粒超螺旋单体比例。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程，具体涉及一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法及其产品和应用。

技术介绍

1、利用大肠杆菌进行基因合成和质粒发酵生产时，质粒产物存在多种构型：超螺旋、线性和开环。超螺旋构型是双链dna分子的共价闭环结构，线性构型是质粒dna两条链在同一处断裂形成的形态，开环质粒dna是两条链中有一条链发生一处或多处断裂。正常情况下，超螺旋结构的质粒占主要部分，线性和开环是在生产过程中超螺旋质粒受到破坏所出现的构型。

2、在质粒产物中也经常存在一些复杂的、分子量更大的杂质，就是质粒的二聚体或多聚体，它们由超螺旋单体质粒间发生同源重组所产生。超螺旋构型的聚体质粒受外力破坏后也会形成聚体的线性或开环形态。

3、一般情况下，超螺旋单体是质粒生产中需要获得的主要部分，它被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达量的质粒形态，所以超螺旋单体质粒的占比是衡量质粒质量的重要指标。在基因治疗和dna疫苗的研究中，监管机构对药用质粒的超螺旋含量做出了明确的指导建议。一些研究机构和企业在进行基因治疗产品研发时，也会对质粒的超螺旋本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包括：sgRNA、同源重组序列和Cas9；

3.根据权利要求2所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1或sgRNA2；所述sgRNA1的靶DNA序列如SEQ ID NO.25所示，所述sgRNA2的靶DNA序列如SEQ ID NO.26所示。

4.根据权利要求2或3所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆...

【技术特征摘要】

1.一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑系统包括：sgrna、同源重组序列和cas9；

3.根据权利要求2所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述sgrna包括sgrna1或sgrna2；所述sgrna1的靶dna序列如seq id no.25所示，所述sgrna2的靶dna序列如seq id no.26所示。

4.根据权利要求2或3所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述同源重组序列、靶向sgrna序列与线性化后的ptarget-blue质粒载体连接得到同源重组质粒；

5.根据权利要求1-4中任一项所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：

6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌由权利要求1-5中任一项所述的提高...

【专利技术属性】
技术研发人员：张博文，邓凤，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：