【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法及其产品和应用。
技术介绍
1、利用大肠杆菌进行基因合成和质粒发酵生产时，质粒产物存在多种构型：超螺旋、线性和开环。超螺旋构型是双链dna分子的共价闭环结构，线性构型是质粒dna两条链在同一处断裂形成的形态，开环质粒dna是两条链中有一条链发生一处或多处断裂。正常情况下，超螺旋结构的质粒占主要部分，线性和开环是在生产过程中超螺旋质粒受到破坏所出现的构型。
2、在质粒产物中也经常存在一些复杂的、分子量更大的杂质，就是质粒的二聚体或多聚体，它们由超螺旋单体质粒间发生同源重组所产生。超螺旋构型的聚体质粒受外力破坏后也会形成聚体的线性或开环形态。
3、一般情况下，超螺旋单体是质粒生产中需要获得的主要部分，它被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达量的质粒形态，所以超螺旋单体质粒的占比是衡量质粒质量的重要指标。在基因治疗和dna疫苗的研究中，监管机构对药用质粒的超螺旋含量做出了明确的指导建议。一些研究机构和企业在进行基因治疗产品研发时，也会对质粒的超螺旋单体比例提出明确要求，以确保其具有良好的转化和表达效率。但质粒聚体的出现会较大程度地影响质粒超螺旋单体的比例，尤其是多拷贝或者含有重复序列的质粒更容易形成质粒聚体，从而增加质粒生产的难度。工业上生产质粒产品时会通过琼脂糖凝胶电泳和高效液相色谱分析的方法检测超螺旋单体的占比，对产品进行质量检测。
4、怎样减少质粒聚体的产生，这一直是质粒生产中亟待解决的技术难题。当前解
5、然而，理论上可以减少同源重组提高质粒纯度的reca1和reca13突变，在实际生产中的使用效果有限，经常出现使用商业菌株仍然导致质粒形态不佳，使超螺旋单体比例无法达到交付标准的情况。
6、现有技术的缺点是在一些质粒的生产时，对于聚体形成的抑制作用有限。在实际生成中，使用reca1或者reca13突变菌株生产多腺苷(polya)、抗体、慢病毒、抗体可变区甚至常见的puc质粒时，仍然会出现质粒聚体过多的情况。因此，改进现有菌株，优化目前存在的聚体过多问题，并提供一种大肠杆菌基因改造的方法，在质粒生产中具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法及其产品和应用。本专利技术改进了现有菌株，优化了目前存在的聚体过多问题，提供一种大肠杆菌基因改造的方法，采用该方法能显著减少质粒聚体的产生，提高质粒超螺旋单体比例。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，所述方法包括：
4、采用crispr/cas9基因编辑系统敲除宿主大肠杆菌的基因组中的两段dna序列，所述dna序列包括：reca+基因编码序列和recf+基因编码序列；
5、所述reca+基因编码序列5’端至3’端的核苷酸序列如seq id no.1所示；
6、所述recf+基因编码序列5’端至3’端的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、本专利技术中，所述宿主大肠杆菌包括工程菌株dh5a、stable3或top10等常用的大肠杆菌。
8、本专利技术中，在基因组水平上同时敲除重组大肠杆菌工程菌株基因组中的两段dna序列，这两个基因的同时敲除后，可以减少质粒聚体产生，提高质粒超螺旋单体比例。
9、本专利技术中，reca+基因编码参与dna同源重组过程的关键重组酶reca。在dna间发生同源重组时会先发生双链dna的断裂，然后核酸外切酶会沿着5’端至3’端的方向将其中一条dna单链消化，一次形成一段单链dna部分。重组酶reca会与单链dna结合，形成蛋白质-dna丝状复合物，并寻找同源双链dna作为断裂修复的模板。
10、本专利技术中，recf+基因编码的是重组酶recf不仅能催化reca蛋白在单链dna上的组装，还可以与其他rec蛋白相互作用，帮助启动同源重组过程。根据同源重组中dna底物的不同，引起双链dna断裂的途径不同。当质粒作为dna底物发生同源重组时，主要遵循recf途径。
11、本专利技术中，使用reca+和recf+基因编码序列同时敲除的大肠杆菌菌株进行质粒生产，可以有效减少质粒聚体的产生，提高超螺旋单体质粒的比例，效果优于仅对reca+进行点突变改造的多种商业化大肠杆菌菌株。
12、优选地，所述crispr/cas9基因编辑系统包括：sgrna、同源重组序列和cas9。
13、优选地，所述同源重组序列包含reca+基因编码序列或recf+基因编码序列敲除所需的上、下游同源臂。
14、优选地，所述上、下游同源臂的长度各自独立的为400-600bp，优选为450-550bp。例如可以是400bp、420bp、440bp、450bp、460bp、480bp、500bp、520bp、540bp、550bp、560bp、580bp或600bp等。
15、优选地，所述cas9由peccas9质粒表达得到。
16、优选地，所述sgrna包括sgrna1或sgrna2；所述sgrna1的靶dna序列如seq idno.25所示，所述sgrna2的靶dna序列如seq id no.26所示。
17、本专利技术中，所述同源臂是位于基因组上所敲除部分上下游的序列，是基于敲除部分的序列进行设计。
18、本专利技术中，所述reca+基因编码序列敲除所需的上游同源臂包括seq id no.3所示。
19、本专利技术中，所述reca+基因编码序列敲除所需的下游同源臂包括seq id no.6所示。
20、本专利技术中，所述recf+基因编码序列敲除所需的上游同源臂包括seq id no.15所示。
21、本专利技术中，所述recf+基因编码序列敲除所需的下游同源臂包括seq id no.18所示。
22、优选地，所述同源重组序列、靶向sgrna序列与线性化后的ptarget-blue质粒载体连接得到同源重组质粒。
23、优选地，敲除reca+基因编码序列的同源重组质粒由同源重组序列a、reca+本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统包括：sgRNA、同源重组序列和Cas9；
3.根据权利要求2所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1或sgRNA2；所述sgRNA1的靶DNA序列如SEQ ID NO.25所示，所述sgRNA2的靶DNA序列如SEQ ID NO.26所示。
4.根据权利要求2或3所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述同源重组序列、靶向sgRNA序列与线性化后的pTarget-Blue质粒载体连接得到同源重组质粒；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌由权利要求1-5中任一项所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法的制备得到
7.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1或sgRNA2；所述sgRNA1的靶DNA序列如SEQ ID NO.25所示，所述sgRNA2的靶DNA序列如SEQ ID NO.26所示。
8.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由同源重组序列、靶向sgRNA序列与线性化后的pTarget-Blue质粒载体连接得到；所述靶向sgRNA序列由启动sgRNA转录的启动子、权利要求7所述的sgRNA的靶DNA序列和gRNA骨架序列依次连接得到；
9.一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括权利要求7所述的sgRNA、权利要求8所述的重组质粒和Cas9。
10.权利要求1-5中任一项所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法、权利要求7所述的sgRNA、权利要求8所述的重组质粒或权利要求9所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统中任意一种或至少两种的组合在大肠杆菌基因改造中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑系统包括：sgrna、同源重组序列和cas9；
3.根据权利要求2所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述sgrna包括sgrna1或sgrna2；所述sgrna1的靶dna序列如seq id no.25所示，所述sgrna2的靶dna序列如seq id no.26所示。
4.根据权利要求2或3所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述同源重组序列、靶向sgrna序列与线性化后的ptarget-blue质粒载体连接得到同源重组质粒；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的提高质粒超螺旋单体比例的大肠杆菌基因改造方法，其特征在于，所述方法包括：
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌由权利要求1-5中任一项所述的提高...
【专利技术属性】
技术研发人员：张博文，邓凤，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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