【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物，尤其涉及一种谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除cho细胞系的制备方法及其应用。
技术介绍
1、中国仓鼠卵巢(cho)细胞是一种来源于中国仓鼠卵巢的上皮细胞系，是生物制药行业制造治疗性蛋白主要手段之一，也是生产单克隆抗体的主要工具之一。可以快速识别大量低产和非生产性细胞中的那些稀有高产细胞系，达成有效和高效的临床细胞系开发过程，对于加速生物药物开发具有重大意义。
2、在细胞培养中，谷氨酰胺一方面用于细胞的能量代谢，另一方面参与蛋白质的合成和核酸代谢。在没有或低谷氨酰胺的培养条件下，谷氨酰胺合成酶(gs)催化谷氨酸和铵离子合成生成谷氨酰胺，供给细胞代谢和蛋白质合成。甲硫氨酸磺酸盐(msx)是gs的竞争型抑制剂，msx结合到gs的谷氨酸盐位点之后，会被atp磷酸化，从而不可逆的抑制gs活性。gs/msx筛选系统广泛应用于筛选基于cho细胞的蛋白类药品工程细胞株。通常目的蛋白基因和gs基因被共同转染到细胞内，gs基因作为筛选标记基因表达谷氨酰胺合成酶，使阳性细胞能在低或无谷氨酰胺条件下生长。随后，通过逐渐提高msx的浓度筛选细胞种群中有高拷贝、能高表达gs基因的细胞。这些细胞一般也携带更高拷贝数的目的基因，并能高表达目的基因蛋白。另外利用gs/msx方法构建的工程细胞株在培养时无需加入谷氨酰胺，极大减少了代谢废物-氨在培养基中的积累，具有培养工艺易于优化，质控容易，蛋白表达量高等优点。
3、工业化生产重组抗体通常选择敲除了内源性的gs基因的cho细胞株作为宿主细胞，虽然其细胞无法在谷氨酰胺缺失的
4、目前能够成熟应用于gs基因敲除的生物技术主要有四种：同源重组、锌指核酸酶(zfn)、类转录激活因子效应物核酸酶(talen)以及原核生物后天免疫系统(簇间规则间隔短回文重复序列，crispr)。传统的同源重组法通过构建基因打靶载体，利用左右同源臂的重组，实现外源基因替代目的基因片段。虽然这种方法容易实施，但是打靶效率非常低，理论上同源重组事件仅发生在宿主细胞基因组复制进行的短促时间段。据统计，在小鼠的胚胎干细胞(es)中同源重组的效率仅在百万分之一，而在cho细胞中同源重组的效率甚至远低于es细胞。zfn、talen，以及crispr技术的成功专利技术与改进，极大地方便了科研人员对于原核细胞、真核细胞等进行基因组层面的细微精准操作，在构建时间和敲除效率上，较传统的同源重组而言，zfn、talen以及crispr三大编辑技术明显更具优势。然而这三种方法仍然受其原理机制的限定，均具有不同程度且不可忽视的脱靶效应。简言之，这三种方法仅依靠非常简短的引导单元或引导序列，定位到目的序列附近，在核酸酶的作用下完成基因组的切割，容易因错配导致核酸酶对非目标区域进行切割。单就cho细胞基因组而言，对于一个标准的gn19ngg靶标序列，cho-k1的基因组中平均有6个完全相同的序列、377个有一个核苷酸误配的序列、4558个有两个核苷酸误配的序列。用crispr技术定点改造基因而获得的转基因小鼠在全基因组层面甚至出现多达1397个单核苷酸突变和117处dna序列的插入或缺失。如此多的遗传和表观不确定性，使得该法产生的敲除细胞株难以作为医用蛋白生产的通用性工程细胞株，并且较难获得国家药监局和美国食品药品监督局的许可。
5、cn116716253a公开了一种gs基因敲除的cho细胞株及其构建方法与应用。所述gs基因敲除的cho细胞株的构建方法，采用的sgrna截短成17bp，其敲除效率相较于传统长度的20bp sgrna，略有提升，但是未能根本上解决或避免如何降低crispr技术的脱靶效应。
6、综上所述，如何提供一种在安全性、敲除精准度、脱靶效应、敲除效率和筛选效率等方面都兼备优势、且真正被生物制药行业接受应用于实际cho细胞工程株改造的方法，已成为目前本领域亟待解决的问题之一。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除cho细胞系的制备方法及其应用，本专利技术提供的方法极大地提高了传统同源重组的打靶效率，显著降低传统同源重组法非特异性整合的概率。同时本专利技术提供的敲除阳性细胞系筛选方法，能较易获得无抗性筛选标记残留谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除阳性cho细胞系，提高筛选效率，并且敲除获得的细胞系倍增快，密度高，产量高，稳转细胞池pool可达g/l级别。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种同源重组打靶序列，所述同源重组打靶序列的核酸序列包括seq id no.1所示的序列。
4、seq id no.1：tggcagggatatcgtggaggctcactaccgcgcctgcttgtatgctggggtcaagattacaggaacaaatgct gaggtcatgcctgcccaggtaaatggcactattctgttccttttcctcccctctgaagacttggcacatggggactttggttaacaagggtgatgacttaaaagtggttcagggtagaggtaagtagaacaagctaggagcttgagttggcctgaacagttagttggccttattctaaaggtcaacatgttctttctagtgggaattccaaataggaccctgtgaagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaact本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同源重组打靶序列，其特征在于，所述同源重组打靶序列的核酸序列包括SEQID NO.1所示的序列。
2.一种谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：使用权利要求1所述的同源重组打靶序列敲除CHO细胞的谷氨酰胺合成酶基因。
3.根据权利要求2所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述打靶序列的DNA包含于重组腺相关病毒载体中；
4.根据权利要求2或3所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系的制备方法，其特征在于，所述获得谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系前，还包括获取单克隆CHO细胞系的基因组DNA，通过基因组DNA的测序数据筛选所述谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系；
6.一种谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系由权利要求2～5任一项所述的谷氨酰
7.根据权利要求6所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系，其特征在于，所述细胞系含有编码目的蛋白的核酸分子；
8.如权利要求1所述的同源重组打靶序列、权利要求2～5任一项所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系的制备方法、权利要求6或7所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除CHO细胞系中的任意一种或至少两种的组合在表达目的蛋白或制备表达目的蛋白的工程化细胞中的应用；
9.一种表达目的蛋白的方法，其特征在于，所述表达目的蛋白的方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的表达目的蛋白的方法，其特征在于，所述目的蛋白包括抗体；
...【技术特征摘要】
1.一种同源重组打靶序列，其特征在于，所述同源重组打靶序列的核酸序列包括seqid no.1所示的序列。
2.一种谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除cho细胞系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：使用权利要求1所述的同源重组打靶序列敲除cho细胞的谷氨酰胺合成酶基因。
3.根据权利要求2所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除cho细胞系的制备方法，其特征在于，所述打靶序列的dna包含于重组腺相关病毒载体中；
4.根据权利要求2或3所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除cho细胞系的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除cho细胞系的制备方法，其特征在于，所述获得谷氨酰胺合成酶双等位基因敲除cho细胞系前，还包括获取单克隆cho细胞系的基因组dna，通过基因组dna的测序数据筛选所述谷氨酰胺合成酶双等位...
【专利技术属性】
技术研发人员：高大伟，蔺智勇，马燕，王耀楠，阚子义，罗顺，
申请(专利权)人：澳斯康生物南通股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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