【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法。
技术介绍
1、5’-app oligo，全称为5’,5’-adenylyl pyrophosphoryl oligonucleotide，即5’,5’-腺苷焦磷酰寡核苷酸，其结构中包含一个高能焦磷酸键，这种腺苷焦磷酰化修饰也被称作rapp修饰。
2、天然的5’-app oligo在寡核苷酸连接中发挥重要作用。以t4 rna连接酶为例，在连接反应中，t4 rna连接酶的一个赖氨酸残基与atp反应形成“amp-酶中间产物”，这个中间体将其腺苷基转移到5’端单磷酸化的rna的5’端，形成活跃的中间产物5’-apprna；接着5’-apprna和另一个rna的3’-oh反应形成磷酸二酯键。大部分dna或rna连接酶都遵循以上描述的三步连接机制，因此形成5’-app oligo是寡核苷酸连接的关键。合成预腺苷焦磷酰化的oligo，可以在不存在atp的条件下实现寡核苷酸的连接，有助于进行与连接相关的实验研究。为了避免5’-app oligo自连，oligo的3’端通常会设置封闭基团(如双脱氧核苷酸或3’-氨基连接基团)来进行封端，避免后续应用到连接反应中时产生app oligo的重复连接。
3、5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸，一般都是通过酶法合成，如cn105441429a公开一种制备腺苷酰化接头的方法及腺苷酰化接头，在酶法合成中，t4 dna连接酶能在没有受体dna的情况下将5’-磷酸dna供体定量转化为appdna。但是酶法合成有个两
4、综上所述，如何简便、稳定地合成5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸，是核酸连接领域亟需解决的问题之一。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，以期实现高效、稳定、低成本地制备5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸。
2、为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，所述方法包括以下步骤：
4、取待修饰的寡核苷酸与咪唑修饰的单磷酸脱氧腺嘌呤核苷和溶剂混合，进行修饰反应，得到所述5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸。
5、本专利技术中，开发一种5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，化学合成法合成的成本较酶法合成低，且不需要模板链，同时腺苷焦磷酰化的效率对底物序列没有依赖性，更加稳定。
6、可以理解，本专利技术设计5’-腺苷焦磷酰化修饰的化学方法，可实现对任意的寡聚核酸进行修饰，寡聚核酸具体序列及长度可根据需求选择，如21～50bp的引物等。
7、优选地，所述待修饰的寡核苷酸和咪唑修饰的单磷酸脱氧腺嘌呤核苷的摩尔比为1:(250～500)，包括但不限于1:251、1:255、1:260、1:280、1:300、1:350、1:400、1:420、1:450、1:460、1:470、1:480或1:490。
8、优选地，所述待修饰的寡核苷酸与溶剂的配比为(150～250)nmol:1ml，包括但不限于151nmol:1ml、152nmol:1ml、155nmol:1ml、160nmol:1ml、180nmol:1ml、190nmol:1ml、200nmol:1ml、210nmol:1ml、220nmol:1ml、230nmol:1ml、240nmol:1ml或245nmol:1ml。
9、优选地，所述溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺。
10、优选地，所述修饰反应的温度为40～60℃，包括但不限于41℃、42℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、52℃、55℃、56℃、57℃、58℃或59℃，时间为24～48h，包括但不限于25h、26h、27h、28h、29h、30h、32h、35h、38h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h或47h。
11、优选地，所述待修饰的寡核苷酸的制备方法包括固相合成法。
12、本专利技术中，可采用固相合成法合成待修饰的寡核苷酸用于进行5’-腺苷焦磷酰化修饰，实现核酸的定制合成及修饰。
13、优选地，所述固相合成法包括脱保护、偶联、氧化和盖帽。
14、优选地，所述脱保护的脱保护试剂包括三氯乙酸溶液。
15、优选地，所述偶联的活化剂包括乙硫基四氮唑溶液。
16、优选地，所述氧化的氧化剂包括碘溶液。
17、优选地，所述盖帽的盖帽试剂包括乙酸酐溶液和n-甲基咪唑溶液。
18、优选地，由所述固相合成法合成的待修饰的寡核苷酸还需经过脱保护处理。
19、优选地，所述脱保护处理包括：
20、将所述固相合成法合成的待修饰的寡核苷酸与吡啶、n,o-双三甲硅基乙酰胺和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯混合。
21、优选地，所述脱保护处理的温度为30～50℃，包括但不限于31℃、32℃、33℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、46℃、47℃、48℃或49℃，时间为30～60min，包括但不限于31min、32min、33min、34min、35min、38min、40min、42min、45min、48min、50min、52min、55min、56min、57min、58min或59min。
22、优选地，所述修饰反应后还包括氨解处理和乙醇沉淀的步骤。
23、优选地，所述氨解处理包括将所述修饰反应的产物与氨水混合，进行氨解反应。
24、优选地，所述氨解反应的温度为65℃，时间为2h。
25、优选地，所述乙醇沉淀包括将所述氨解处理的产物与乙醇混合，进行沉淀；
26、优选地，所述沉淀的温度为-20℃，时间为2h。
27、优选地，所述5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法包括以下步骤：
28、(1)利用固相合成法合成待修饰的寡核苷酸；
29、(2)去除所述待修饰的寡核苷酸的5’端磷酸保护基团；
30、(3)将步骤(2)处理后寡核苷酸与咪唑修饰的单磷酸脱氧腺嘌呤核苷和溶剂混合，进行修饰反应；
31、(4)将步骤(3)产物进行氨解处理；
32、(5)将步骤(4)产物进行乙醇沉淀，得到所述5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸。
33、作为优选的技术方案，所述5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法具体包括以下步骤：
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【技术保护点】
1.一种5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述待修饰的寡核苷酸和咪唑修饰的单磷酸脱氧腺嘌呤核苷的摩尔比为1:(250～500)；
3.根据权利要求1或2所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺。
4.根据权利要求1-3任一项所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述修饰反应的温度为40～60℃，时间为24～48h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述待修饰的寡核苷酸的制备方法包括固相合成法。
6.根据权利要求5所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述固相合成法包括脱保护、偶联、氧化和盖帽；
7.根据权利要求5或6所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，由所述固相合成法合成的待
8.根据权利要求5-7所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述修饰反应后还包括氨解处理和乙醇沉淀的步骤；
9.根据权利要求1-8任一项所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法包括以下步骤：
10.根据权利要求1-9任一项所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法具体包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述待修饰的寡核苷酸和咪唑修饰的单磷酸脱氧腺嘌呤核苷的摩尔比为1:(250～500)；
3.根据权利要求1或2所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺。
4.根据权利要求1-3任一项所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述修饰反应的温度为40～60℃，时间为24～48h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的5’-腺苷焦磷酰化修饰的寡核苷酸的化学合成方法，其特征在于，所述待修饰的寡核苷酸的制备方法包括固相合成法。
6.根据权利要求5所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：周方园，卜梅杰，郑佳琳，郝军政，唐芦波，董梓钰，
申请(专利权)人：苏州金唯智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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