一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法技术方案

本发明专利技术提供一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子Ppbr表达调控。由双向筛选系统表达验证和表达优化结果得铅离子与铅结合蛋白结合筛选条件为铅离子50μM、氨苄青霉素100μg/mL；锌离子与铅结合蛋白结合减弱的优化压力筛选条件为锌离子50μM、蔗糖10％，与锌离子结合较强的细胞因蔗糖敏感抑制生长。优化条件为铅结合蛋白定向进化的压力筛选条件，用于减弱非目标金属离子锌离子的干扰，实现铅结合蛋白的特异性定向进化；为该类金属调控蛋白的特异性优化提供了新的筛选工具。

Construction of a Bidirectional Screening System for Directed Evolution of Lead Binding Proteins

The invention provides a method for constructing a bidirectional screening system for directional evolution of lead-binding proteins. The bidirectional screening system is composed of ampicillin-resistant gene and sacB-fructose sucrase gene, which are regulated by the expression of lead-binding protein PbrR and specific promoter Ppbr. The results of expression verification and expression optimization showed that the screening conditions for binding of lead ion to lead binding protein were 50 mu M of lead ion and 100 mu/mL of ampicillin. The optimal pressure screening conditions for weakening binding of zinc ion to lead binding protein were 50 mu M of zinc ion and 10% of sucrose. Cells with strong binding of zinc ion inhibited growth because of sucrose sensitivity. The optimized conditions are pressure screening conditions for directional evolution of lead-binding proteins, which can be used to reduce the interference of non-target metal ions such as zinc ions and achieve specific directional evolution of lead-binding proteins, and provide a new screening tool for the specific optimization of such metal-binding proteins.

【技术实现步骤摘要】
一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法
本专利技术涉及一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，为提高金属调控蛋白的特异性结合提供帮助。
技术介绍
铅结合蛋白源于耐金属贪铜菌CupriavidusmetalliduransCH34质粒pMOL30的铅抗性操纵子pbr，该操纵子可同时实现铅离子摄取、转出和富集，形成了该菌株针对铅离子的主要防线。铅结合蛋白PbrR操纵着Ppbr启动子下游结构基因pbrABCD的铅离子依赖的诱导转录，对于铅离子的调控起到了关键作用。铅结合蛋白PbrR表达后形成同源二聚体与操纵子DNA结合，当铅离子存在时其改变蛋白质与DNA复合物的构象导致DNA解开螺旋呈现打开结构，启动下游基因的表达。随着铅结合蛋白PbrR研究的发展，基于其构建的金属特异性生物传感器对于重金属铅离子监测领域具有重要的现实的应用价值。铅结合蛋白PbrR属于MerR家族，但研究表明MerR家族负责锌、镉和铅吸收和泵出的蛋白往往同时转运三种金属离子。因此铅结合蛋白PbrR作为金属响应元件虽然可以选择性识别铅离子，对于非目标金属离子锌离子等也具有一定的结合能力，局限了该金属调控蛋白对于金属离子特异性检测的应用潜力。近些年一些巧妙的双向筛选系统设计应用于转录调控蛋白的压力选择定向进化，调整改造蛋白的化合物结合特异性，产生能分别被各种不同小分子化合物所诱导的调控蛋白且已经取得明显成效。Collins等人应用catA-bli-bla组成的筛选系统进行定向进化彻底改变了群体感应转录激活剂LuxR的响应特异性，野生型LuxR响应3OC6HSL激活下游基因表达，筛选得到的变体LuxR-G2E-R67M不再响应3OC6HSL，而是结合直链酰基HSL激活基因表达，该筛选系统为识别目标LuxR变体提供了一种有效可行的筛选方法。同时随着反向筛选标记的研究发展，由正反向筛选标记组成的双向筛选系统可作为一种优化的筛选系统应用于该类转录调控蛋白的定向筛选进化中。在特定的筛选条件下，含有反向筛选标记表达的细胞会死亡，而不含或难以表达该基因的细胞能够存活下来，可用于双向筛选标记的反向筛选，避免了选择合适抗性基因用于反向筛选的问题。因此，正反向筛选标记构成的双向筛选系统可考虑应用于铅结合蛋白PbrR特异性增强的定向改造中，进一步提高天然金属调控蛋白的应用价值。本专利技术涉及的用于铅结合蛋白PbrR定向进化的双向筛选系统构建方法中，利用抗性基因作为正向筛选标记、研究较早较深入的果聚糖蔗糖酶基因作为反向筛选标记用于构建双向筛选系统，正向筛选标记表达氨苄青霉素抗性使其在抗性条件下存活，反向筛选标记表达可使得细胞对蔗糖敏感从而抑制生长。经过表达验证和条件优化，本方法可优化获得合适的筛选条件，它可作为条件压力选择应用于铅结合蛋白PbrR的特异性增强定向进化中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的金属调控蛋白铅结合蛋白的特异性优化方法，即构建双向筛选系统并优化筛选条件，应用于模拟自然选择压力下的铅结合蛋白的定向进化。本专利技术的技术方案如下：一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，其受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子Ppbr的表达调控。用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，包括如下步骤：(1)利用大肠杆菌E.coliDH5α作为宿主，构建以铅结合蛋白基因pbrR和启动子Ppbr的SEQIDNo.1的核苷酸序列、氨苄青霉素抗性基因amp如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列、果聚糖蔗糖酶基因sacB核苷酸序列为SEQIDNo.3的顺序排列的筛选质粒底盘细胞；(2)金属铅离子条件下的双向筛选系统表达验证，同浓度铅锌离子条件下的双向筛选系统条件优化以优选合适的筛选条件。所述步骤(1)的筛选质粒底盘细胞构建包括扩增带有同源区域的基因片段、GibsonAssembly连接片段、转化验证筛选质粒。所述步骤(2)中的金属离子条件下的双向筛选系统表达验证和条件优化，依据目标金属离子铅离子与铅结合蛋白结合启动双向筛选系统的表达，直接水解氨苄青霉素表达氨苄青霉素抗性，铅结合蛋白与铅离子结合的细胞正常存活；干扰金属离子锌离子与铅结合蛋白结合启动双向筛选系统的表达，添加蔗糖细胞敏感抑制生长，锌离子与铅结合蛋白结合减弱的细胞通过压力选择进化存活。其中包括铅离子正向筛选标记的表达验证、铅离子反向筛选标记的表达验证、铅锌离子同浓度时正向筛选标记的表达优化、铅锌离子同浓度时反向筛选标记的表达优化。具体说明如下：步骤(1)的筛选质粒底盘细胞构建，包括扩增基因片段、GibsonAssembly连接片段、转化验证筛选质粒，具体操作如下：①扩增基因片段：设计带有同源片段约20bp的引物，具体引物设计如表1所示，利用高保真聚合酶分别扩增基因片段基础的载体骨架基因片段(引物H1F和H1R)、铅结合蛋白基因pbrR和启动子Ppbr的SEQIDNo.1的核苷酸序列(引物H2F和H2R)、氨苄青霉素抗性基因amp如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列(引物H3F和H3R)和果聚糖蔗糖酶基因sacB的核苷酸序列SEQIDNo.3(引物H4F和H4R)，然后切胶回收各基因片段；表1设计的引物序列②GibsonAssembly连接片段：依据GibsonAssembly原理连接含有同源区域的基因片段构建成环状质粒；③转化验证筛选质粒：利用热激法将连接体系转化至宿主细胞大肠杆菌E.coliDH5α，菌落PCR验证阳性克隆，得到正确的筛选质粒底盘细胞。步骤(2)的金属离子条件下的双向筛选系统表达验证和条件优化，包括铅离子正向筛选标记的表达验证、铅离子反向筛选标记的表达验证、铅锌离子同浓度时正向筛选标记的表达优化、铅锌离子同浓度时反向筛选标记的表达优化，具体方法如下：①铅离子正向筛选标记的表达验证：铅离子结合铅结合蛋白可表达氨苄青霉素抗性，细胞存活。以1％比例转接OD600约为0.6的菌液至添加铅离子和氨苄青霉素的LB液体培养基，铅离子终浓度设置为0、1、5、10、20、50μM的浓度梯度，氨苄青霉素溶液终浓度为100μg/mL，37℃、220rpm条件培养测定筛选质粒底盘细胞生长曲线。②铅离子反向筛选标记的表达验证：铅离子结合铅结合蛋白可表达下游的反向筛选标记，蔗糖添加使细胞敏感而抑制生长。以1％比例转接OD600约为0.6的菌液至添加铅离子和蔗糖的LB液体培养基，铅离子终浓度设置为0、5、20、50μM的浓度梯度，蔗糖比例10％，30℃、220rpm条件培养测定筛选质粒底盘细胞生长曲线。③铅锌离子同浓度时正向筛选标记的表达优化：以1％比例转接OD600约为0.6的菌液至添加氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基，铅离子、锌离子浓度都分别设置为20μM和50μM并分别添加进行37℃、220rpm条件下的摇瓶培养。④铅锌离子同浓度时反向筛选标记的表达优化：以1％比例转接OD600约为0.6的菌液至添加蔗糖10％的LB液体培养基，铅离子、锌离子浓度都分别设置为20μM和50μM并分别添加进行30℃、220rpm条件下的摇瓶培养。合适的优化筛选条件确定：铅结合蛋白与铅离子结合的优化压力条件为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，其特征是采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，其受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子Ppbr的表达调控。

【技术特征摘要】
1.一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，其特征是采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，其受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子Ppbr的表达调控。2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤如下：(1)利用大肠杆菌E.coliDH5α作为宿主，构建以铅结合蛋白基因pbrR和启动子Ppbr的SEQIDNo.1的核苷酸序列、氨苄青霉素抗性基因amp如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列、果聚糖蔗糖酶基因sacB核苷酸序列为SEQIDNo.3的顺序排列的筛选质粒底盘细胞；(2)金属铅离子条件下的双向筛选系统表达验证，铅离子锌离子条件下的双向筛选系统条件优化以优选合适的筛选条件。3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤(1)的筛选质粒底盘细胞构建包括扩增带有同源区域的基因片段、GibsonAssembly...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾晓强，赵婷婷，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12