一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法技术方案

本发明专利技术提供一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子Ppbr表达调控。由双向筛选系统表达验证和表达优化结果得铅离子与铅结合蛋白结合筛选条件为铅离子50μM、氨苄青霉素100μg/mL；锌离子与铅结合蛋白结合减弱的优化压力筛选条件为锌离子50μM、蔗糖10％，与锌离子结合较强的细胞因蔗糖敏感抑制生长。优化条件为铅结合蛋白定向进化的压力筛选条件，用于减弱非目标金属离子锌离子的干扰，实现铅结合蛋白的特异性定向进化；为该类金属调控蛋白的特异性优化提供了新的筛选工具。

Construction of a Bidirectional Screening System for Directed Evolution of Lead Binding Proteins

The invention provides a method for constructing a bidirectional screening system for directional evolution of lead-binding proteins. The bidirectional screening system is composed of ampicillin-resistant gene and sacB-fructose sucrase gene, which are regulated by the expression of lead-binding protein PbrR and specific promoter Ppbr. The results of expression verification and expression optimization showed that the screening conditions for binding of lead ion to lead binding protein were 50 mu M of lead ion and 100 mu/mL of ampicillin. The optimal pressure screening conditions for weakening binding of zinc ion to lead binding protein were 50 mu M of zinc ion and 10% of sucrose. Cells with strong binding of zinc ion inhibited growth because of sucrose sensitivity. The optimized conditions are pressure screening conditions for directional evolution of lead-binding proteins, which can be used to reduce the interference of non-target metal ions such as zinc ions and achieve specific directional evolution of lead-binding proteins, and provide a new screening tool for the specific optimization of such metal-binding proteins.

【技术实现步骤摘要】
一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法
本专利技术涉及一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，为提高金属调控蛋白的特异性结合提供帮助。
技术介绍
铅结合蛋白源于耐金属贪铜菌CupriavidusmetalliduransCH34质粒pMOL30的铅抗性操纵子pbr，该操纵子可同时实现铅离子摄取、转出和富集，形成了该菌株针对铅离子的主要防线。铅结合蛋白PbrR操纵着Ppbr启动子下游结构基因pbrABCD的铅离子依赖的诱导转录，对于铅离子的调控起到了关键作用。铅结合蛋白PbrR表达后形成同源二聚体与操纵子DNA结合，当铅离子存在时其改变蛋白质与DNA复合物的构象导致DNA解开螺旋呈现打开结构，启动下游基因的表达。随着铅结合蛋白PbrR研究的发展，基于其构建的金属特异性生物传感器对于重金属铅离子监测领域具有重要的现实的应用价值。铅结合蛋白PbrR属于MerR家族，但研究表明MerR家族负责锌、镉和铅吸收和泵出的蛋白往往同时转运三种金属离子。因此铅结合蛋白PbrR作为金属响应元件虽然可以选择性识别铅离子，对于非目标金属离子锌离子等也具有一定的结合能力，局限了该金属调控蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，其特征是采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，其受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子Ppbr的表达调控。

【技术特征摘要】
1.一种用于铅结合蛋白定向进化的双向筛选系统构建方法，其特征是采用正向筛选标记氨苄青霉素抗性基因amp和反向筛选标记果聚糖蔗糖酶基因sacB构成双向筛选系统，其受铅结合蛋白PbrR及特异性启动子Ppbr的表达调控。2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤如下：(1)利用大肠杆菌E.coliDH5α作为宿主，构建以铅结合蛋白基因pbrR和启动子Ppbr的SEQIDNo.1的核苷酸序列、氨苄青霉素抗性基因amp如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列、果聚糖蔗糖酶基因sacB核苷酸序列为SEQIDNo.3的顺序排列的筛选质粒底盘细胞；(2)金属铅离子条件下的双向筛选系统表达验证，铅离子锌离子条件下的双向筛选系统条件优化以优选合适的筛选条件。3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤(1)的筛选质粒底盘细胞构建包括扩增带有同源区域的基因片段、GibsonAssembly...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾晓强，赵婷婷，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12