使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法技术

本发明专利技术涉及一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，采用新型常压室温等离子体射流诱变系统构建降解甲醛菌株的诱变育种体系，结合高浓度甲醛梯度双层琼脂培养基筛选手段，获得一系列高活性耐受甲醛降解效率发生变化的突变株。制备的诱变菌株在相比国内外报到的甲醛耐受浓度有了极大的提高,进而能在较高浓度下降解甲醛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于等离子体技术在生物学领域的应用，具体涉及一种利用常压室温等离子体诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法。
技术介绍
甲醛是一种无色有强烈刺激性气味的有机污染物，其主要污染源来自有机合成、塑料、涂料、装潢材料及油漆等行业排放的废气、废水等，由于甲醛在接触部位较易被吸收进入人体，可再经呼吸道吸收后引起生物细胞核基因突变、损害DNA；高浓度甲醛则对神经系统、免疫系统等都有毒害，国际癌症研究机构（IARC）已将甲醛上升为第I类致癌物质，因此对甲醛污染物进行防治工作对人类健康意义重大。目前去除甲醛污染的方法有活性炭吸附、纳米光催化、臭氧负离子、植物分解等，但这些方法存在药剂消耗量大、费用高、不能将甲醛有效去除等缺点。而生物法降解甲醛具有效果好，成本低、无二次污染等优点，因此筛选分离具有较强降解甲醛污染物的微生物已成为近年来国内外研究热点，降解效果总体来说是低浓度到高浓度筛选趋势。目前甲醛降解菌株没有较高的耐受甲醛浓度，这是一个重大的难题。由清华大学与北京思清源生物科技有限公司联合自主研发的新型常压室温等离子体（ARTP）生物诱变育种技术，由于其具有射流温度低（25~35℃），活性粒子分布均匀，对人体和环境无危害，操作简易等优势，因此ARTP为利用系统生物学和合成生物学手段构建高性能菌株提供了平台方法。但目前未见有关于使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法的报道。
技术实现思路
为了解决上述现有技术问题，本专利技术的目的在于提供一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，采用该方法制备的诱变菌株在甲醛耐受浓度有了极大的提高,进而能在较高浓度下降解甲醛。本专利技术的技术方案如下：一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，包括如下步骤：1）利用ARTP诱变装置对筛选出的甲醛降解菌株进行诱变,以99.99%氦气作为工作气体，在电源功率为115W、工作气流量为10L/min、等离子体发射源与菌株之间的距离为2mm，操作温度23.0~35.0°C,诱变处理时间0.5min～3min；2）配制甲醛浓度在1000~15000mg/L呈线性梯度的琼脂平板培养基，一端浓度高，另一端浓度低，在双层梯度平板上涂布经过ARTP诱变后的菌株，30℃恒温培养数天，挑选高浓度区域内生长良好的菌落接入斜面培养基，得到高活性耐受甲醛突变株。所述筛选出的甲醛降解菌株为假单胞菌，菌株为阴性菌，菌株呈短杆状。作为本专利技术进一步的改进，所述诱变处理时间为2min，其致死率控制在99%以上，可能有利于提高菌株对甲醛的耐受程度和提高对甲醛的降解效率，综合考虑能源节约等因素，选取ARTP处理时间2min为最佳诱变剂量作为上述方案的进一步改进，所述突变株的抑制浓度为10000mg/L≤MIC≤15000mg/L，此为ARTP处理时间2min是突变株的最低抑制浓度，相对野生菌株在500mg/L的甲醛平板中良好的生长状况，2min突变株对甲醛的耐受性提高近20倍之多。所述筛选出的甲醛降解菌株经过富集培养和菌株分离得到，所述1）富集培养：将长期浸泡废水的活性污泥各5g加入100mLLB培养基的锥形瓶中搅拌静置，LB培养基（g/L）：蛋白胨10重量份，酵母膏5重量份，Nacl10重量份，蒸馏水1l，调pH至7.0，1×105Pa灭菌20min，取2mL上清液加入到浓度50mg/L甲醛为碳源的LB培养基中，置于150r/min摇床上30°C振荡培养，3d转接1次菌液，每次按2%（m/v）接种量转接到新鲜培养基中振荡培养，如此重复10次，同时将甲醛浓度从50mg/L增加到100mg/L；2）菌株分离：利用倍比稀释法涂布于含甲醛（50mg/L）的固体平板上，将平板上长出的单菌落编号并多次划线纯化，以确保菌株的纯度和甲醛降解性能的稳定。附图说明图1分离株的菌落及在显微镜下观察的菌体形态；图2菌株W1的生长曲线与甲醛降解率曲线图；图3菌株W1的ARTP诱变致死率曲线；图4突变菌的部分菌落放大示意图；图5高活性突变株对不同质量浓度甲醛降解过程。具体实施方式下面结合附图，详细介绍本专利技术的实施例。1.1菌株的筛选分离从安徽芜湖中天印染厂采集活性污泥（长期被印染废水浸泡）作为菌种筛选样品。1.2试剂与仪器牛肉膏，蛋白胨，甲醛溶液质量分数为37%，Nacl，MgSO4，FeSO4·7H2O，MnSO4·H2O，CaCl2·2H2O，(NH4)2SO4，KH2PO4和K2HPO4等系上海国药集团化学试剂有限公司提供，均为分析纯。MG96GTMPCR扩增仪朗基科学仪器有限公司；TGL-16G高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂；UV-2100分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司；OlympusCX41生物显微镜奥林巴斯公司；DYCP-31D水平电泳槽北京市六一仪器厂；SZ-97自动三重纯水蒸馏器上海本波仪器有限公司；扫描电镜(ScanningElectronicMicroscope,SEM)FEIQuanta200为安徽工程大学生物实验中心公用仪器。1.3培养基及培养条件LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，Nacl10，蒸馏水1l，调pH至7.0，1×105Pa灭菌20min。基本无机盐培养基（g/L）：(NH4)2SO41.0，K2HPO42.16，MgSO40.1，KH2PO40.85，MnSO4·H2O0.05，CaCl2·H2O0.03，FeSO4·7H2O0.01，加蒸馏水定容至1L，调pH至7.0，0.68×105Pa灭菌30min。乙酰丙酮溶液：6mL冰乙酸、50g乙酸铵、0.5mL乙酰丙酮及100mL蒸馏水。培养条件：以下实验如无特别情况，均在30°C恒温培养箱振荡培养，摇床转速150r/min，培养24h。1.4实验方法1.4.1甲醛降解菌的筛选分离：富集培养：收集长期浸泡印染废水的活性污泥各5g加入100mLLB培养基的锥形瓶中搅拌静置，取2mL上清液加入到浓度50mg/L甲醛为碳源的LB培养基中，置于150r/min摇床上30°C振荡培养。3d转接1次菌液，每次按2%（m/v）接种量转接到新鲜培养基中振荡培养，如此重复10次，同时将甲醛浓度从50mg/L增加到100mg/L。菌株分离：利用倍比稀释法涂布于含甲醛（50mg/L）的固体平板上，将平板上长出的单菌落编号并多次划线纯化，以确保菌株的纯度和甲醛降解性能的稳定。1.4.2菌株W1生长曲线的绘制与降解甲醛的测定将分离筛选出的菌株按2%接种量（m/v）接种在甲醛浓度为100mg/L的LB培养液中，30°C条件下，转速150r/min摇床上振荡培养，以LB培养液为空白对照，每2h在灭菌超净台迅速移取1mL于灭菌的离心管中，取1mL菌液于414nm波长处测光密度OD值，作出OD-t曲线，同步取样测定培养液在414nm处的甲醛含量。参照本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，包括如下步骤：1）利用ARTP诱变装置对筛选出的甲醛降解菌株进行诱变,以99.99%氦气作为工作气体，在电源功率为115W、工作气流量为10 L/min、等离子体发射源与菌株之间的距离为2mm，操作温度23.0~35.0 °C,诱变处理时间0.5 min～3 min；2）配制甲醛浓度在1000~15000mg/L呈线性梯度的琼脂平板培养基，一端浓度高，另一端浓度低，在双层梯度平板上涂布经过ARTP诱变后的菌株，30℃恒温培养数天，挑选高浓度区域内生长良好的菌落接入斜面培养基，得到高活性耐受甲醛突变株。

【技术特征摘要】
1.一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，包括如下步骤：
1）利用ARTP诱变装置对筛选出的甲醛降解菌株进行诱变,以99.99%氦气作为工作气体，在电源功率为115W、工作气流量为10L/min、等离子体发射源与菌株之间的距离为2mm，操作温度23.0~35.0°C,诱变处理时间0.5min～3min；
2）配制甲醛浓度在1000~15000mg/L呈线性梯度的琼脂平板培养基，一端浓度高，另一端浓度低，在双层梯度平板上涂布经过ARTP诱变后的菌株，30℃恒温培养数天，挑选高浓度区域内生长良好的菌落接入斜面培养基，得到高活性耐受甲醛突变株。
2.根据权利要求1所述的使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，其特征在于：所述筛选出的甲醛降解菌株为假单胞菌。
3.根据权利要求1所述的使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，其特征在于：所述诱变处理时间为2min。
4.根据权利要求3所述的使用ARTP诱变筛选高活性耐受...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔芳，郭凤献，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34