一种针对c‑Myc标签的单域重链抗体制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体为针对c‑Myc标签的单域重链抗体，其具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，可用于免疫检测、抗原富集纯化等领域。本发明专利技术所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和性、特异性、稳定性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

A single domain heavy chain antibody to C Myc Tags

The invention belongs to the field of gene engineering, in particular to a single domain heavy chain antibody to C Myc label, which has an amino acid sequence of SEQ ID NO.1 shown, can be used for the enrichment and purification of antigen immune detection, etc.. The amino acid sequence provided by the invention can be used as the precursor, through alteration or random mutagenesis, can obtain the properties (affinity, specificity and stability) better mutants, for the development of industry, agriculture and medicine for further protein or peptide.

【技术实现步骤摘要】
一种针对c-Myc标签的单域重链抗体
本专利技术涉及单域重链抗体技术(又称纳米抗体技术)，以及基因工程抗体技术，特别是针对c-Myc标签的单域重链抗体或多肽。技术背景c-Myc标签蛋白的发现源于1985年Evan制备获得了一株针对人原癌基因产物Myc蛋白的单克隆抗体9E10，此后研究发现该抗体识别的表位由10个氨基酸残基组成，其序列为Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，并且这10个氨基酸与其它蛋白融合表达后依然能够保持很强的抗原活性，可以被相应抗体识别，而且不受到蛋白框架的影响。因此，c-Myc标签系统广泛应用于免疫学检测、细胞成像、亲和纯化以及蛋白质工程等领域。本专利技术公开了一种可以与c-Myc标签特异性结合的单域重链抗体(即纳米抗体，下同)，可用于c-Myc标签融合蛋白的检测及纯化。目前市场上已经有针对c-Myc标签的单克隆或多克隆抗体用于检测，但单克隆抗体的研发和生产过程及其繁琐和复杂，多克隆抗体来源有限。相比之下，单域重链抗体仅由一个结构域组成，具有耐酸碱、耐高温、特异性高、分子量小和可大规模生产等优点，用单域重链抗体作为配基制备的纯化介质具有成本低、可重复使用等优点，应用前景广阔。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供针对c-Myc标签的单域重链抗体，可以被用于制备检测和纯化c-Myc标签的试剂和工具。本专利技术提供一个针对c-Myc标签的单域重链抗体(即本专利技术一种针对c-Myc标签的单域重链抗体，下同)，具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的IMGT编号和结构域的划分包括四个框架区(Frameworkregion,FR)和三个互补决定区(Complementarity-determiningregion,CDR)。本专利技术提供一个核酸分子，其特征是编码SEQIDNO.:1，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。本专利技术还提供一个核酸分子，其特征是编码SEQIDNO.:1部分结构域，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。可以为SEQIDNO.:2核酸分子。本专利技术所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。本专利技术还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。本专利技术还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。本专利技术还提供一种检测c-Myc标签的方法，含有本专利技术所述针对c-Myc标签的单域重链抗体。基于本专利技术提供的针对c-Myc标签的单域重链抗体与c-Myc标签特异性结合的能力，建立c-Myc标签的检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，荧光免疫法(Fluoroimmunoassay,FIA)，免疫芯片法，亲和层析法和免疫层析法等。本专利技术所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，该突变体能与c-Myc标签特异性结合。本专利技术还涉及前述针对c-Myc标签的单域重链抗体在免疫检测、富集以及纯化中的应用。这些免疫检测指的是非疾病诊断治疗目的的免疫检测。本专利技术还涉及针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料，包括载体，搭载在载体上的配基，其特征在于该材料以针对c-Myc标签的纳米抗体作为配基，所述针对c-Myc标签的纳米抗体具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。载体材料不限于琼脂糖凝胶，也可以选用硅球、纳米磁珠等。本专利技术所叙述的一些术语具有如下含义：结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。IMGT编号：IMGT数据库(TheInternationalImMunoGeneTicsDatbase)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenman,F.,Q.Kaas,et.al.(2010).IMGT/3Dstructure-DBandIMGT/DomainGapAlign：adatabaseandatoolforimmunoglobulinsorantibodies,Tcellreceptors,MHC,IgSFandMhcSF.NucleicAcidsRes38(Databaseissue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,etal.(2003).IMGTuniquenumberingforimmunoglobulinandTcellreceptorvariabledomainsandIgsuperfamilyV-likedomainsDevcompImmunol27(1):55-77.)中的描述。密码子(codon)：又称为三连体密码子(tripletcode)，指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。具体实施方式下面通过单域重链抗体(多肽)的制备、分析及应用，对本专利技术做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本专利技术的应用范围。实施例1：抗c-Myc标签单域重链抗体(即针对c-Myc标签的单域重链抗体)免疫文库的构建将c-Myc标签与牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)共价偶联，得到c-Myc人工抗原c-Myc-BSA，取300μgc-Myc-BSA与弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼(Lamapacos)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150μgc-Myc-BSA与弗氏不完全佐剂乳化，间隔2周进行，每次免疫7天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价最高的样品分离淋巴细胞，提取RNA。RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。以RNA为模板，oligodT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因(采用的引物见表1)。第一轮PCR分别以引物AlpVh-LD和CH2-R扩增cDNA，反应条件为，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20个循环，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。将第一轮PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作为第二轮PCR的模板，分别用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，进行扩增，反应条件为，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5个循环，98℃，10s，68℃，40s，30个循环，72℃延伸10min。经DNA片段回收试剂盒回收、定量，于-20℃保存备用。将噬菌粒pHEN1和PCR扩增产物分别用SfiI、NotI双酶切，经琼脂糖凝胶回收、定量后，以1∶3摩尔比，在16℃，过夜连接。表1文库构建及鉴定所用的引物注：下划线表示限制性内切酶识别序列连接产物经乙醇沉淀后，溶于10μL无菌水，分十次进行电穿孔转化大肠杆菌TG1。取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对c‑Myc标签的纳米抗体，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种针对c-Myc标签的纳米抗体，具有SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列。2.一种核酸分子，其特征是编码权利要求1中所述氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于序列如SEQIDNO.:2。4.一种包含权利要求2所述的核酸序列的载体。5.一种包含权利要求4所述的载体的宿主细胞。6.权利要求1所述的针对c-Myc标签的纳米抗体在免疫检测、富集纯化c-Myc标签中的应用。7.权利要求1所述的针对...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂追，付金衡，吴红静，许杨，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36