一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法，属于基因工程技术领域。具体地，包括合成具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段；构建重组质粒pET20b‑BA‑pun，并进而构建基因工程菌BL21/pET20b‑BA‑pun，诱导该基因工程菌即可得到合成利巴韦林的关键酶，即嘌呤核苷磷酸化酶。利用基因工程菌合成利巴韦林，转化率高、成本低、绿色环保，在工业生产中具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法
本专利技术属于基因工程
，具体地，涉及一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法。
技术介绍
利巴韦林(Ribavirin)是一种高效广谱抗病毒核苷类药物，对多种DNA和RNA病毒都有强效的抑制作用，具有疗效较高、活性较强、副作用少、不易产生耐药性等特点，被广泛应用于治疗流感、口腔疱疹、流行性出血热、病毒性肝炎等病毒疾病，具有巨大的治疗潜力和医疗用途。利巴韦林的制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶法合成三种。其中化学法研究与报道最为广泛，但由于其工艺复杂、成本高、环境污染严重等原因已被大多数生产企业淘汰。发酵法则存在生产周期长、容易污染杂菌、提取工艺复杂以及能耗高等缺点。酶法是以嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)为催化剂，以廉价底物鸟苷和TCA为原料合成利巴韦林，具有反应时间短、副产物少、产物容易分离、操作简单、环境污染少、能耗少等优点，具有较大的工业化市场前景。嘌呤核苷磷酸化酶(purinenucleosidephosphorylase，PNPase，EC:2.4.2.1)是嘌呤补救途径的关键酶之一，也是合成利巴韦林的关键酶，广泛存在于原核和真核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备能够表达具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段的基因工程菌；(2)诱导表达步骤1)所述的基因工程菌，将诱导培养得到的菌液经离心和洗涤后，收集细胞菌体；(3)以磷酸钾缓冲液为反应溶剂，以鸟苷和1,2,4‑三氮唑‑3‑甲酰胺为反应底物，在反应底物中加入上述细胞菌体作为酶源并混合均匀；(4)将混合均匀后的反应体系放入摇床进行酶转化；(5)反应结束后将反应体系置于冰水浴中冷却1，12000r/min离心5min得上清液，即为包括利巴韦林的溶液。

【技术特征摘要】
1.一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备能够表达具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段的基因工程菌；(2)诱导表达步骤1)所述的基因工程菌，将诱导培养得到的菌液经离心和洗涤后，收集细胞菌体；(3)以磷酸钾缓冲液为反应溶剂，以鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺为反应底物，在反应底物中加入上述细胞菌体作为酶源并混合均匀；(4)将混合均匀后的反应体系放入摇床进行酶转化；(5)反应结束后将反应体系置于冰水浴中冷却1，12000r/min离心5min得上清液，即为包括利巴韦林的溶液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中(1)制备能够表达具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段的基因工程菌的步骤包括：1)合成具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段；2)将合成的pun基因片段与载体pET20b连接成重组质粒pET20b-BA-pun；3)将重组质粒pET20b-BA-pun转化到大肠杆菌DH5α；4)筛选阳性克隆，并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中(2)诱导表达步骤(1)所述的基因工程菌的步骤包括：将基因工程菌BL21/pET20b-BA-pu...

【专利技术属性】
技术研发人员：高淑红，戴芳萍，邱蔚然，卢姗，李旭，邱志云，周洁，黄佳雯，
申请(专利权)人：南通秋之友生物科技有限公司，华东理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32