提取高纯度核蛋白和膜蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了提取高纯度核蛋白和膜蛋白的方法。具体地，本发明专利技术提供了一种提取核蛋白和/或膜蛋白的方法，包括步骤：(1)提供细胞样品；(2)匀浆步骤，对步骤(1)中的细胞样品进行N次匀浆处理，得到匀浆后的细胞悬浮液，其中N为≥1的正整数，优选N为20‑100，更优选N为25‑50，最优选N为30；(3)低速离心步骤，对步骤(2)中的细胞悬浮液进行低速离心处理，得到沉淀物1和上清液1；(4)膜蛋白获取步骤，和/或核蛋白获取步骤；(5)任选地，核蛋白和膜蛋白定量和质检步骤。

【技术实现步骤摘要】
提取高纯度核蛋白和膜蛋白的方法
本专利技术涉及生物
，具体地涉及提取高纯度核蛋白和膜蛋白的方法。
技术介绍
细胞是生物体生命活动的基本结构单位和功能单位，由不同细胞器或者亚细胞结构构成的多区室单位。动物细胞可以粗略地划分为细胞核和细胞浆区室，细胞核内的蛋白统称为核蛋白，细胞浆中的蛋白统称为浆蛋白，细胞浆内细胞器的膜蛋白，细胞核的膜蛋白和细胞质膜蛋白统称为膜蛋白。相应地，如果直接将细胞充分裂解提取细胞内所有的蛋白，则称之为细胞总蛋白提取；如果需要提取细胞内细胞核的蛋白，则称之为核蛋白提取；如果只需要提取细胞内细胞器的膜蛋白，细胞核的膜蛋白和细胞质膜蛋白，则称之为膜蛋白提取。无论是在科学研究还是在工业生产中，经常需要提取核蛋白和膜蛋白用来满足特定的研发试验。相比于蛋白得率，核蛋白和膜蛋白的纯度往往是更为重要的参数；如果核蛋白和膜蛋白纯度不符合要求，往往会导致研发试验结果的差强人意甚至失败。评判核膜蛋白和膜蛋白提取优劣，不仅仅要参考蛋白提取效率，还需要评判核蛋白和膜蛋白的纯度，即核蛋白或者膜蛋白中污染其他区域蛋白的程度。理论上核蛋白和膜蛋白的得率越高，其他蛋白污染程度越小(即核蛋白或者膜蛋白纯度越高)，说明核蛋白和膜蛋白提取效果越好。目前文献报道或者商业化试剂盒提供的方法都是分开提取核蛋白或者膜蛋白。对于核蛋白提取，目前的提取方法大同小异，基本都是先用低渗溶液或者等渗溶液加去垢剂破坏细胞质膜，然后低速离心富集细胞核；但都没有后续进一步的细胞核纯化步骤，导致所提取核蛋白纯度并不高。对于膜蛋白提取，一般都是先用低渗溶液使细胞吸水胀破，然后低速离心去除细胞核，再高速离心富集膜碎片，最后使细胞膜溶解；但目前他人的方法对于膜蛋白溶解较为忽视，其实膜蛋白由于存在较多疏水结构域，其溶解方式需要十分注意。虽然有大量的文献报道核蛋白和膜蛋白的提取方法，也有很多商业化试剂盒专门用于提取核蛋白或者膜蛋白，但他们一般至少存在以下两个弊端：1.核蛋白和膜蛋白的纯度无法保证，对于纯度要求很高的研发试验无能为力；2.核蛋白和膜蛋白需要分开提取，既无法充分有效利用样品，也不能用于需要严格平行对照组的研发试验。
技术实现思路
针对现有技术的上述两大弊端，本专利技术通过丰富和优化提取溶液配方和相关实验步骤，能够同时提取得到高纯度的核蛋白和膜蛋白，既能满足特定研发试验对蛋白纯度的要求，也能够明显降低样品需求量和试验成本，还能满足需要核蛋白，膜蛋白和浆蛋白作为严格平行对照组的研发试验要求。本专利技术的目的主要用于同时提取高纯度的核蛋白和膜蛋白。在本专利技术的第一方面，提供了一种提取核蛋白和/或膜蛋白的方法，包括步骤：(1)提供细胞样品；(2)匀浆步骤，对步骤(1)中的细胞样品进行N次匀浆处理，得到匀浆后的细胞悬浮液，其中N为≥1的正整数，优选N为20-100，更优选N为25-50，最优选N为30；(3)低速离心步骤，对步骤(2)中的细胞悬浮液进行低速离心处理，得到沉淀物1和上清液1；(4)膜蛋白获取步骤，和/或核蛋白获取步骤；(5)任选地，核蛋白和膜蛋白定量和质检步骤；所述膜蛋白获取步骤包括：(a1)高速离心步骤，对步骤(3)中得到的上清液1进行高速离心处理，得到沉淀物2和沉淀物3；(b1)膜蛋白溶解和收集步骤，对步骤(4)中得到的沉淀物2进行溶解，得到上清液2，所述上清液2中含有膜蛋白；所述核蛋白获取步骤包括：(a2)任选地，细胞核(i)密度梯度离心步骤和(ii)洗涤步骤；(b2)核蛋白收集和超滤步骤，得到上清液3，所述上清液3中含有核蛋白。在本专利技术的第二方面，提供了一种同时提取核蛋白和膜蛋白的方法，包括步骤：(1)提供细胞样品；(2)匀浆步骤，对步骤(1)中的细胞样品进行N匀浆处理，得到匀浆后的细胞悬浮液，其中N为≥1的正整数，优选N为20-100，更优选N为25-50，最优选N为30；(3)低速离心步骤，对步骤(2)中的细胞悬浮液进行低速离心处理，得到沉淀物1和上清液1；(4)膜蛋白获取步骤和核蛋白获取步骤；(5)任选地，核蛋白和膜蛋白定量和质检步骤；所述膜蛋白获取步骤包括：(a1)高速离心步骤，对步骤(3)中得到的上清液1进行高速离心处理，得到沉淀物2和沉淀物3；(b1)膜蛋白溶解和收集步骤，对步骤(4)中得到的沉淀物2进行溶解，得到上清液2，所述上清液2中含有膜蛋白；所述核蛋白获取步骤包括：(a2)任选地，细胞核(i)密度梯度离心步骤和(ii)洗涤步骤；(b2)核蛋白收集和超滤步骤，得到上清液3，所述上清液3中含有核蛋白。在另一优选例中，所述步骤(2)中，细胞匀浆步骤之后，还包括至少一次镜检步骤。在另一优选例中，所述步骤(2)中匀浆步骤中，加入细胞沉淀体积的10倍，优选2-8倍、更优选3-5倍体积的低渗裂解溶液。在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述低渗裂解溶液为：10mMHEPES(pH7.5),1.5mMMgCl2,10mMKCl,5mMEDTA,1mMDTT,1mMCocktailandPMSF。在另一优选例中，所述步骤(2)中，匀浆次数N为10-200，优选N为20-100，更优选N为25-50，最优选N为30。在另一优选例中，所述步骤(2)中，还包括往低渗裂解溶液中添加TritonX-100溶液的步骤。在另一优选例中，所述TritonX-100在低渗裂解溶液中的终浓度为0.01％-0.2％，优选0.03％-0.15％，更优选0.05％-0.1％。在另一优选例中，所述步骤(2)中，要使绝大部分细胞被裂解释放出膜碎片和浆蛋白，同时也要保持细胞核完整。在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述低速离心步骤为在2-10℃下离心，优选4℃。在另一优选例中，所述步骤(3)中，所述低速离心步骤为4℃下2000g离心10分钟。在另一优选例中，所述沉淀物1中包括细胞核和任选地，没有裂解的完整细胞。在另一优选例中，所述上清液1中包括浆蛋白，膜碎片，细胞器，细胞骨架和任选地，少量破碎的细胞核。在另一优选例中，所述步骤(a1)中，所述高速离心步骤为4度下14000rpm离心30分钟。在另一优选例中，所述步骤(a1)中，所述沉淀物2中包括膜碎片。在另一优选例中，所述步骤(a1)中，所述沉淀物2为淡黄色沉淀。在另一优选例中，所述步骤(a1)中，所述沉淀物3中包括细胞骨架。在另一优选例中，所述步骤(a1)中，所述沉淀物3为白色絮状沉淀。在另一优选例中，所述步骤(a1)中，所述沉淀物3位于所述沉淀物2上层。在另一优选例中，所述步骤(b1)中，所述溶解为用1％的SDS溶液直接溶解，得到膜蛋白溶液。在另一优选例中，所述膜蛋白溶液中的膜蛋白已经变性。在另一优选例中，所述1％的SDS溶液溶解于PBS中。在另一优选例中，所述步骤(b1)中，所述溶解为用1％或者2％TritonX-100溶液溶解，得到膜蛋白溶液。在另一优选例中，所述膜蛋白溶液中的膜蛋白未变性。在另一优选例中，所述1％或者2％TritonX-100溶液溶解于PBS中，添加1mMPMSF和DTT。在另一优选例中，所述步骤(b1)中，所述溶解为冰上溶解20-60分钟，优选30分钟。在另一优选例中，所述步骤(b1)中，所述上清液2为将膜蛋白溶液在4度下14000rpm高速离心20分钟收集得到。在另一优选例中，所述步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取核蛋白和/或膜蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供细胞样品；(2)匀浆步骤，对步骤(1)中的细胞样品进行N次匀浆处理，得到匀浆后的细胞悬浮液，其中N为≥1的正整数，优选N为20‑100，更优选N为25‑50，最优选N为30；(3)低速离心步骤，对步骤(2)中的细胞悬浮液进行低速离心处理，得到沉淀物1和上清液1；(4)膜蛋白获取步骤，和/或核蛋白获取步骤；(5)任选地，核蛋白和膜蛋白定量和质检步骤；所述膜蛋白获取步骤包括：(a1)高速离心步骤，对步骤(3)中得到的上清液1进行高速离心处理，得到沉淀物2和沉淀物3；(b1)膜蛋白溶解和收集步骤，对步骤(4)中得到的沉淀物2进行溶解，得到上清液2，所述上清液2中含有膜蛋白；所述核蛋白获取步骤包括：(a2)任选地，细胞核(i)密度梯度离心步骤和(ii)洗涤步骤；(b2)核蛋白收集和超滤步骤，得到上清液3，所述上清液3中含有核蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种提取核蛋白和/或膜蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供细胞样品；(2)匀浆步骤，对步骤(1)中的细胞样品进行N次匀浆处理，得到匀浆后的细胞悬浮液，其中N为≥1的正整数，优选N为20-100，更优选N为25-50，最优选N为30；(3)低速离心步骤，对步骤(2)中的细胞悬浮液进行低速离心处理，得到沉淀物1和上清液1；(4)膜蛋白获取步骤，和/或核蛋白获取步骤；(5)任选地，核蛋白和膜蛋白定量和质检步骤；所述膜蛋白获取步骤包括：(a1)高速离心步骤，对步骤(3)中得到的上清液1进行高速离心处理，得到沉淀物2和沉淀物3；(b1)膜蛋白溶解和收集步骤，对步骤(4)中得到的沉淀物2进行溶解，得到上清液2，所述上清液2中含有膜蛋白；所述核蛋白获取步骤包括：(a2)任选地，细胞核(i)密度梯度离心步骤和(ii)洗涤步骤；(b2)核蛋白收集和超滤步骤，得到上清液3，所述上清液3中含有核蛋白。2.一种同时提取核蛋白和膜蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供细胞样品；(2)匀浆步骤，对步骤(1)中的细胞样品进行N匀浆处理，得到匀浆后的细胞悬浮液，其中N为≥1的正整数，优选N为20-100，更优选N为25-50，最优选N为30；(3)低速离心步骤，对步骤(2)中的细胞悬浮液进行低速离心处理，得到沉淀物1和上清液1；(4)膜蛋白获取步骤和核蛋白获取步骤；(5)任选地，核蛋白和膜蛋白定量和质检步骤；所述膜蛋白获取步骤包括：(a1)高速离心步骤，对步骤(3)中得到的上清液1进行高速离心处理，得到沉淀物2和沉淀物3；(b1)膜蛋白溶解和收集步骤，对步骤(4)中得到的沉淀物2进行溶解，得到上清液2，所述上清液2中含有膜蛋白；所述核蛋白获取步骤包括：(a2)任选地，细胞核(i)密度梯度离心步骤和(ii)洗涤步骤；(b2)核蛋白收集和超滤步骤，得到上清液3，所述上清液3中含有核蛋白。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b1)中，所述溶解为用1％的SDS溶液直接溶解，得到膜蛋白溶液。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b1)中，所述溶解为用1％或者2％TritonX-100溶液溶解，得到膜蛋白溶液。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a2)中，所述(i)密度梯度离心步骤包括：在EP管最底层铺1.5M-2.3Msucrose溶液，然后再铺60％-65％Percoll溶液，再将细胞核悬浮液1轻轻铺在最上层。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(a2)中，所述(i)密度梯度离心步骤还包括：将细胞核聚集物轻轻从Percoll溶液中吸取出来，用NT等渗洗涤溶液稀释后，进行离心处理1，然后吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：程时颂，翁炜宁，王朝晖，孟逊，
申请(专利权)人：艾比玛特医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31