二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法和应用，该方法通过将二维金属有机骨架纳米片与富集溶液混合分散，再加入磷酸化肽样品进行富集，富集后离心，除去上清液，后加入洗涤溶液，涡旋、离心，除去上清液；最后加入洗提溶液，超声、涡旋后进行洗提，得到富集的磷酸化肽段。本发明专利技术将该纳米片用于富集磷酸化肽段，其展现出高效的富集能力、极低的检测限和极高的抗干扰能力，相比于商业化的固定化金属离子亲和色谱法和金属氧化物亲和色谱法时，富集效率有了极大的提高；同时对于复杂样品的检测也展现出良好的效果，本发明专利技术提供的纳米片具有适用范围广、选择性好、灵敏度高等优异性能，有利于大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】
二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法和应用
本专利技术涉及磷酸化肽富集应用
，具体涉及一种二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法和应用。
技术介绍
金属有机骨架材料(Meatal-OrganicFrameworks,MOFs)是一类多孔晶体材料，其具有一些独特的性质，例如超高的比表面积且孔容大，孔表面容易功能化改性等特点，因此常被用于气体吸附于分离，催化，能量存储和二氧化碳捕获。二维MOFs纳米片是目前研究的热点，而它们的应用却主要集中在能量存储，膜分离和传感等方面。二维MOFs纳米片的主要优点包括形态良好的二维片层结构，大的活性表面积和良好的分散性，因此其具有可被用于富集磷酸化肽的潜在可能性。蛋白磷酸化参与着许多细胞反应过程，其在调控蛋白活性和功能方面发挥着重要作用。基于质谱(MassSpectrometry,MS)的蛋白质组学是一种有效的检测磷酸化蛋白/磷酸化肽的手段。但是，磷酸化肽的浓度很低(低于1×10-9M)，因此从复杂生物样品中检测磷酸化肽面临着巨大的挑战。检测磷酸化肽的灵敏度经常受到低的电离效率，高丰度的其他肽段的干扰，以及直接MS分析时磷酸化肽的信号被抑制等问题。为了解决这些问题，在蛋白质组研究中实现对磷酸化肽的高效富集吸引了越来越多的关注。截至目前，各种各样的方法技术和材料被用于选择性富集磷酸化肽，包括离子交换色谱法，免疫共沉淀法，化学衍生法，固定化金属离子亲和色谱法和金属氧化物亲和色谱法。IMAC方法的富集原理基于磷酸基团和固定化的金属离子的配位螯合作用，例如Al3+，Ti4+和Zr4+，但是IMAC材料有时候可能需要复杂的合成过程。MOAC方法富集的原理是基于磷酸基团和金属氧化物表面形成桥连的二齿配体，例如Al2O3，TiO2和ZrO2。但是MOAC材料特异性富集效果不佳，同时在富集过程中也会造成磷酸化肽的丢失。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法和应用，所述的方法采用二维MOFs纳米片富集样品中的磷酸化肽段，纳米片材料合成过程简易，产量高，富集方法简单，解决现有技术中商业化亲和材料富集效率低的缺点，并展现出高效地富集能力(磷酸化肽:非磷酸化肽=1:10000，磷酸化肽浓度为4pmolμL-1)和极低的检测限(1×10-10M)，有利于推广使用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法，包括如下步骤：（1）将二维金属有机骨架纳米片与富集溶液混合后超声使其混合均匀，得到分散溶液；（2）将待分离的磷酸化肽样品加入到上述分散的溶液中，涡旋30min进行富集，二维金属有机骨架纳米片表面丰富的金属结合位点可以与磷酸化肽段中的磷酸基团通过配位作用而结合；（3）富集后离心，除去上清液，后加入洗涤溶液1，涡旋，离心，除去含有非磷酸化肽段的上清液，随后接着加入洗涤溶液2涡旋，离心，除去上清液；（4）洗涤后，加入洗提溶液，超声、涡旋后进行洗提，得到富集的磷酸化肽段。优选的，所述二维金属有机骨架纳米片与富集溶液按固液比0.5~1.0mg：100~200μL的比例混合。优选的，所述磷酸化肽样品与分散溶液中二维金属有机骨架纳米片用量比为0.2~1μL：0.5~1mg。优选的，所述二维金属有机骨架纳米片的厚度3-8nm。优选的，所述富集溶液为乙腈、三氟乙酸和超纯水配制而成的混合溶液，其中乙腈和三氟乙酸的含量分别为40vol%和3vol%；所述洗涤溶液1为乙腈、三氟乙酸和超纯水配制而成的混合溶液，其中乙腈和三氟乙酸的含量分别为50vol%和4vol%；所述洗涤溶液2为乙腈、三氟乙酸和超纯水配制而成的混合溶液，其中乙腈和三氟乙酸的含量分别为30vol%和0.1vol%。优选的，所述洗提溶液为10wt%氨水溶液。优选的，所述二维金属有机骨架纳米片由以下步骤制得：以钛酸异丙酯为金属源，2,5-二羟基对苯二甲酸为有机配体，在溶剂N,N-二乙基甲酰胺中，在密封条件下于200oC反应20h，金属源与有机配体自组装生成三维MOFs，自然冷却降至室温后，离心后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3-5次，室温干燥后在80oC下真空活化处理5h，之后在异丙醇溶液中进行超声剥离2天，随后先在3000rpm下离心，除去下层沉淀的固体，得到上层悬浮液，然后上层悬浮液再在12000rpm下离心，得到二维金属有机骨架纳米片。上述的方法在磷酸化肽段检测中的应用。本专利技术主要是基于二维片层材料来实现对磷酸化肽的特异性富集，并借助于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)来进行检测。二维片层材料具有一些独特的优点，包括形态良好的二维片层形貌，大的比表面积，表面富含可以与磷酸基团相互结合的位点，从而达到富集的效果。通过实验结果得出其具有适用范围广、选择性好、抗干扰能力强、检测限低等优异性能，此方法为磷酸化肽的高效富集提供了新的手段，并且有望在未来的复杂生物样品蛋白质组的大规模分析研究中实现应用。有意效果：与现有技术相比，本专利技术提供了一种二维MOFs纳米片高效富集磷酸化肽段的方法。相比传统的商业化IMAC和MOAC法富集磷酸化肽段的方法，二维MOFs纳米片材料具有较大的比表面积，较高的孔隙率，表面活性位点多，溶解性好易于分散，选择性好、灵敏度高等优异性质。本专利技术通过将二维MOFs纳米片在富集之前用盐溶液处理，抑制非磷酸化肽的吸附，再借助于稳定同位素二甲基标记的方法，将此二维MOFs纳米片应用于检测糖尿病人血清中磷酸化肽的相对含量，具有高效的富集能力、极低的检测限和极高的抗干扰能力。附图说明图1为本专利技术实施例4合成的NTU-9及剥离后二维NTU-9纳米片的扫描电镜图和透射电镜图；图2为本专利技术实施例4剥离后的二维NTU-9纳米片的原子力显微镜图；图3为运用MALDI-TOFMS，检测本专利技术实施例4制备的二维NTU-9纳米片及对照例1合成的Zr-BTB纳米片、对照例2合成的MIL-125和对照例3合成的NH2-MIL-125对标准磷酸化蛋白(β-casein)酶解的磷酸化肽段富集对比的质谱图；图4为运用MALDI-TOFMS，检测本专利技术实施例4制备的二维NTU-9纳米片富集不同浓度下标准磷酸化蛋白(β-casein)酶解后的磷酸化肽段的质谱图；图5为运用MALDI-TOFMS，检测本专利技术实施例4制备的二维NTU-9纳米片富集不同比例下混合的标准非磷酸化蛋白(BSA)与标准磷酸化蛋白(β-casein)酶解后的肽段的质谱图；图6为运用MALDI-TOFMS，检测本专利技术实施例4制备的二维NTU-9纳米片定量检测血清中磷酸化肽段的质谱图；图7为运用MALDI-TOFMS，检测本专利技术实施例4制备的二维NTU-9纳米片富集小鼠不同组织样品中磷酸化肽段的对比图和磷酸化位点的WebLogo图。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本专利技术方案，下面结合附图和实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1在本专利技术中，所述的用二维MOFs纳米片富集标准磷酸化蛋白酶解的磷酸化肽段具体过程如下：首先配制实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将二维金属有机骨架纳米片与富集溶液混合后超声使其混合均匀，得到分散溶液；（2）将待分离的磷酸化肽样品加入到上述分散溶液中，涡旋30 min进行富集，二维金属有机骨架纳米片表面丰富的金属结合位点可以与磷酸化肽段中的磷酸基团通过配位作用而结合；（3）富集后离心，除去上清液，后加入洗涤溶液1，涡旋，离心，除去上清液，随后接着加入洗涤溶液2涡旋，离心，除去上清液；（4）加入洗提溶液，超声、涡旋后进行洗提，得到富集的磷酸化肽段。

【技术特征摘要】
1.一种二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）将二维金属有机骨架纳米片与富集溶液混合后超声使其混合均匀，得到分散溶液；（2）将待分离的磷酸化肽样品加入到上述分散溶液中，涡旋30min进行富集，二维金属有机骨架纳米片表面丰富的金属结合位点可以与磷酸化肽段中的磷酸基团通过配位作用而结合；（3）富集后离心，除去上清液，后加入洗涤溶液1，涡旋，离心，除去上清液，随后接着加入洗涤溶液2涡旋，离心，除去上清液；（4）加入洗提溶液，超声、涡旋后进行洗提，得到富集的磷酸化肽段。2.根据权利要求1所述二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法，其特征在于：所述二维金属有机骨架纳米片与富集溶液按固液比0.5~1mg：100~200μL的比例混合。3.根据权利要求1所述二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法，其特征在于：所述磷酸化肽样品与分散溶液中二维金属有机骨架纳米片用量比为0.2~1μL：0.5~1mg。4.根据权利要求1所述二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法，其特征在于：所述二维金属有机骨架纳米片的厚度3-8nm。5.根据权利要求1所述二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法，其特征在于：所述富集溶液为乙腈...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈健，古志远，杨世庶，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32