本发明专利技术公开了一种基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台，采用非接触式光学测量技术，耦合原子力显微技术与拉曼光谱技术实现超高空间分辨率和超灵敏化学结构信息的同时测量，即针尖增强拉曼测量技术，一方面利用针尖增强拉曼技术突破光学衍射极限，实现纳米级空间分辨率的化学结构信息采集及识别；另一方面，非接触式的光学测量方法可以避免测量过程对DNA样品的损伤；测量精度高，速度快，成本相对较低。
【技术实现步骤摘要】
基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台
本专利技术属于DNA测序的光学装置
，尤其涉及一种基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台。
技术介绍
对于每个生物个体而言，基因组包含了整个生物体的遗传信息。基因测序技术能够真实地反映一个染色体上的全部遗传信息，进而可以全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因此在生命科学研究中，基因测序扮演着一个十分重要的角色。基因测序技术最早可追溯到20世纪50年代，早在1954年Whirfeld等人就己经提出了测量多聚核糖核苷酸的化学降解法。该方法主要是利用磷酸单脂酶的脱磷酸作用以及高碘酸盐的氧化作用将寡核糖核苷酸从链末端逐一分离并测定其种类。但是由于其操作的复杂性，该方法并没有被广泛应用。1977年，Sanger等人提出了经典的双脱氧核糖核苷酸末端终止测序法，该方法的原理是根据双脱氧核苷酸（ddNTP）的2’和3’上都不带有羟基，在DNA的合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA的合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的具有放射性分子的DNA序列。尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其测试的成本太高、速度太慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法而且不适宜大众化。2005年第一次出现了大规模的并行聚合测序仪器，引领了高通量基因测序的新时代，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLID技术的出现为标志了第二代基因测序技术的诞生。第二代基因测序技术不仅仅保持了一代测序技术的高准确度，而且大大降低了基因测序的成本同时极大地提高了测序的速度。但是第二代基因测序技术也存在一定的缺陷，它所能测量的DNA长度较短。随着生物化学、生物物理学、电子学等学科的迅速发展，基于单分子检测的纳米孔测序方法应运而生。基于纳米孔的单分子DNA测序方法，是下一代即第三代基因测序技术中成本最低，最具有竞争力的技术，该方法的原理是首先构造一个纳米孔，当DNA分子通过纳米孔时，由于DNA分子的物理占位，将会引起纳米通道的电阻变化，电阻的变化将导致基准离子电流的变化，形成类似于方波信号的调制电流信号，调制电流信号的波形与生物分子对应的物理信息直接相关。该方法使得DNA测序的速度大大提高，时间大大降低，但该方法的可靠性依赖与纳米孔的可靠与稳定制备，使得该方法的准确性和可靠性不易控制。近年来，针尖增强拉曼技术的发展使得直接通过拉曼光谱识别和研究单分子成为可能。基于此，我们提出一种基于针尖增强拉曼的DNA测序平台。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术公开了基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台，该平台一方面利用非接触式光学检测技术提高检测可靠性，另一方面利用针尖近场增强效果显著提高单各位点光谱的空间分辨率，实现亚纳米尺度DNA碱基光谱信号的直接获取。为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台，利用耦合原子力显微镜测量系统的纳米级空间分辨率技术和拉曼测量系统的超灵敏化学结构探测技术实现DNA样品的表面形貌表征及原位点DNA碱基信号获取；保持纳米级半径的扫描探针针尖与单晶金基底之间间距在3纳米以下，激光激发的针尖和基底上的局域表面等离子体发生共振耦合，使得针尖与金基底形成的纳米间隙内的局域电磁场显著增强到108-1012数量级，此时处于该受限空间的DNA的光学拉曼信号得到增强，同时空间分辨率提高到亚纳米尺度。拉曼光谱作为一种分子指纹光谱随着分子结构变化而变化，DNA中四种不同碱基所产生的针尖增强拉曼光谱各不相同。通过采集DNA链上不同位点的针尖增强拉曼光谱，并与标准碱基光谱作对比获取测量位点处拉曼光谱的产生来源，从而确定该测量位点处的碱基分子信息。通过大面积快速面扫描技术，实现单个DNA链的全空间针尖增强拉曼光谱采集，再利用数据处理，分析，比对技术，得到DNA中碱基的空间分布信息，实现DNA序列的直接获取。其中针尖与激发激光的耦合同轴是针尖增强拉曼测量的关键技术之一。首先通过纳米级压电驱动台控制样品与上部原子力显微镜模块中的针尖，保证针尖与样品之间距离在1~3纳米，然后通过倒置物镜实现激光入射，而入射激光的焦点与针尖的同轴通过连接在物镜底座上的压电驱动台实现。通过测量物镜移动时反射激光信号的强弱判断是否实现激光与针尖的对准。因为当针尖恰好处于激光光斑中心时，由针尖产生的反射信号最强，当物镜聚焦的激光光斑与原子力显微镜的针尖对准完成后，保持针尖与底部物镜的相对位置不变，通过移动中间的样品实现大面积光谱扫描。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用非接触式光学测量技术，耦合原子力显微技术与拉曼光谱技术实现超高空间分辨率和超灵敏化学结构信息的同时测量，即针尖增强拉曼测量技术，既保证DNA测量过程中对DNA试验品的无损检测，又实现DNA碱基信号的可靠区分，测量精度高，速度快，成本相对较低。附图说明图1是本专利技术的DNA测序平台总体图；图2是本专利技术所述的原子力显微镜针尖与拉曼激光对准正视图；图3是本专利技术所述的原子力显微镜针尖与拉曼激光对准俯视图；图4是四种不同碱基拉曼光谱比对图示；图5是针尖增强拉曼实现DNA序列成像图；图6是DNA的典型的针尖增强拉曼光谱。附图标记列表：1.原子力显微镜模块，2.样品台控制模块，3.拉曼光谱采集模块，4.计算机控制的图像采集、处理及显示模块，5.DNA试验品，6.压电驱动位移平台，7.惯性电机驱动的大行程位移平台，8.带针尖的微悬臂，9.二极管激光器，10.四象限光电传感器，11.信号差分放大器，12.针尖运动的反馈控制器，13.压电陶瓷扫描器件，14.压电扫描信号发生器，15.光谱及力学成像，16.白光照明光路，17.白光采集成像光路，18.白光光源，19.半透半反镜一，20.倒置物镜，21.半透半反镜二，22.CCD相机，23.半透半反镜三，24.金三角，25.拉曼激发光路，26.拉曼信号采集管路，27.633纳米激光器，28.激光准直镜，29.聚焦镜，30.共聚焦小孔，31.光谱仪，33.倒置物镜压电驱动台，34.增益反馈，35.参考电压信号，36.DNA样品，37.云母片基底，38.拉曼入射激光束，39.微悬臂上针尖。具体实施方式如图所示，本专利技术所述的基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台，主要由四部分构成：原子力显微镜模块1、样品台控制模块2、显微共聚焦拉曼光谱测量模块3和计算机控制的图像采集、处理及显示模块4。四个模块共同耦合工作，实现DNA样品的测量。显微共聚焦拉曼光谱测量模块3及联动原子力显微镜模块1采用德国Witec公司集成化的型号为alpha300RA产品，样品台控制模块2包含X,Y方向压电驱动的高精度位移平台6和惯性电机驱动的大行程位移平台7。惯性电机驱动的大行程位移平台的最大工作行程为2500微米，精度为100纳米；压电驱动的高精度位移平台最大工作行程为50微米，精度为1纳米。其中压电驱动位移平台通过螺栓固定到惯性电机驱动的大行程位移平台7上，保证两者工作相互独立。所述压电驱动的高精度位移平台6和惯性电机驱动的大行程位移平台7中间设有圆孔，DNA试验品5制备完成后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台，其特征在于：所述仪器平台由四部分构成：原子力显微镜模块（1）、样品台控制模块（2）、显微共聚焦拉曼光谱测量模块（3）和计算机控制的图像采集、处理及显示模块（4）；所述样品台控制模块（2）包含X,Y方向压电驱动的高精度位移平台（6）和惯性电机驱动的大行程位移平台（7）；其中压电驱动位移平台（6）通过螺栓固定到惯性电机驱动的大行程位移平台（7）上，所述压电驱动的高精度位移平台（6）和惯性电机驱动的大行程位移平台（7）中间设有圆孔，DNA试验品（5）通过双面胶固定到圆孔上；所述DNA试验（5）下方为云母片基底（37），云母片基底（37）上方设有金三角（24），金三角（24）表面设有DNA样品（36）；所述原子力显微镜模块（1）包括带针尖的微悬臂（8）以及检测装置，所述检测装置包括二极管激光器（9）、四象限光电传感器（10）、信号差分放大器（11）、控针尖运动的反馈控制器（12）、压电陶瓷扫描器件（13）、信号发生器（14）以及计算机控制的图像采集、处理及显示模块（4）；所述微悬臂（8）的针尖（39）设置在DNA试验品（5）上方1‑3 纳米高度，所述微悬臂（8）固定在压电陶瓷扫描器件（13）上，所述二极管激光器（9）发出的激光束聚焦在微悬臂（8）背面，并从微悬臂背面反射到四象限光斑位置检测器（10）；所述反馈回路（12）和信号放大电路（11）通过分析四象限光斑位置检测器（10）上反射信号得到微悬臂（8）上针尖（39）与DNA试验品相互作用的强度，，改变加在压电陶瓷扫描器件（13）垂直方向的电压，从而使压电管伸缩，调节针尖（39）和DNA试验品（5）间的距离，反过来控制探针与DNA试验品相互作用的强度，实现反馈控制，得到DNA试验品表面形貌信息及力学信息（15）；所述显微共聚焦拉曼光谱测量模块（3）包含两个部分：图像采集光路及拉曼测量光路，所述图像采集光路包括白光照明光路（16）和白光采集成像光路（17）；白光照明光路（16）由白光光源（18）和半透半反镜一（19）组成，白光光源（18）发出的白光经过半透半反镜一（19）反射，再经过圆孔处的倒置物镜（20）聚焦到DNA试验品（5）上；白光采集成像光路（17）包括半透半反镜二（21）和一个CCD相机（22）；白光光源（18）照射DNA试验品反射回来的信号经半透半反镜一（19）、半透半反镜三（23）和半透半反镜二（21）反射进入到CCD相机（22）；所述拉曼测量光路包含拉曼激发光路（25）和拉曼信号采集光路（26）；在拉曼激发光路（25）中，633纳米激光器（27）出射激光束经激光准直镜（28）透射过半透半反镜一（19）、半透半反镜三（23）和半透半反镜二（21）后经由倒置物镜（20）聚焦到DNA试验品（5）上；激光与DNA试验品相互作用后产生拉曼散射光，经由半透半反镜一（19）透射和半透半反镜三（23）反射进入到拉曼信号采集光路（26）；反射后的拉曼散射光经由聚焦镜（29）聚焦通过共聚焦小孔（30）后进入到光谱仪（31）中。...
【技术特征摘要】
1.基于针尖增强拉曼散射光谱技术实现DNA测序的仪器平台，其特征在于：所述仪器平台由四部分构成：原子力显微镜模块（1）、样品台控制模块（2）、显微共聚焦拉曼光谱测量模块（3）和计算机控制的图像采集、处理及显示模块（4）；所述样品台控制模块（2）包含X,Y方向压电驱动的高精度位移平台（6）和惯性电机驱动的大行程位移平台（7）；其中压电驱动位移平台（6）通过螺栓固定到惯性电机驱动的大行程位移平台（7）上，所述压电驱动的高精度位移平台（6）和惯性电机驱动的大行程位移平台（7）中间设有圆孔，DNA试验品（5）通过双面胶固定到圆孔上；所述DNA试验（5）下方为云母片基底（37），云母片基底（37）上方设有金三角（24），金三角（24）表面设有DNA样品（36）；所述原子力显微镜模块（1）包括带针尖的微悬臂（8）以及检测装置，所述检测装置包括二极管激光器（9）、四象限光电传感器（10）、信号差分放大器（11）、控针尖运动的反馈控制器（12）、压电陶瓷扫描器件（13）、信号发生器（14）以及计算机控制的图像采集、处理及显示模块（4）；所述微悬臂（8）的针尖（39）设置在DNA试验品（5）上方1-3纳米高度，所述微悬臂（8）固定在压电陶瓷扫描器件（13）上，所述二极管激光器（9）发出的激光束聚焦在微悬臂（8）背面，并从微悬臂背面反射到四象限光斑位置检测器（10）；所述反馈回路（12）和信号放大电路（11）通过分析四象限光斑位置检测器（10）上反射信号得到微悬臂（8）上针尖（39）与DNA试验品相互作用的强度，，改变加在压电陶瓷扫描器件（13）垂直方向的电压，从而使压电管伸缩，调节针尖（39）和DNA试验品（5）间的距离，反过来控制探针与DNA试验品相互作用的强度，实现反馈控制，得到DNA试验品表面形貌信息及力学信息（15）；所述显微共聚焦拉曼光谱测量模块（3）包含两个部分：图像采集光路及拉曼测量光路，所述图像采集光路包括白光照明光路（16）和白光采集成像光路（17）；白光照明光路（16）由白光光源（18）和半透半反镜一（19）组成，白光光源（18）发出的白光经过半透半反镜一（19）反射，再经过圆孔处的倒置物镜（20）聚焦到DNA试验品（5）上；白光采集成像光路（17）包括半透半反镜二（21）和一个CCD相机（22）；白光光源（18）照射DNA试验品反射回来的信号经半透半反镜一（19）、半透半反镜三（23）和半透半反镜二（21）反射进入到CCD相机（22）；所述拉曼测量光路包含拉曼激发光路（25）和拉曼信号采集光路（26）；在拉曼激发光路（25）中，633纳米激光器（27）出射激光束经激光准直镜（28）透射过半透半反镜一（19）、半透半反镜三（23）和半透半反镜二（21）后经由倒置物镜（20）聚焦到DNA试验品（5）上；激光与DNA试验品相互作用后产生...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈云飞，王永康，张艳，魏志勇，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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