一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，所述致病菌为大肠杆菌和志贺氏菌，所述方法包括以下步骤：(Ⅰ)采用上述两种致病菌的质控菌株制作拉曼增强光谱，包括利用拉曼光谱仪扫上述两种致病菌的质控菌株，以得到拉曼增强光谱；(Ⅱ)利用拉曼光谱仪扫待检测的食品的样品，以得到样品的拉曼光谱，其中拉曼光谱仪的扫描参数与步骤(Ⅰ)一致；(III)将实际样品的拉曼光谱与质控菌株的拉曼光谱进行比对，即根据拉曼光谱的特征峰峰位与强度进行定性识别，或者对实际样品和质控菌株的图谱中的600‑1500cm

【技术实现步骤摘要】
一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法
本专利技术涉及一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，属于食品安全检测领域。
技术介绍
目前致病菌的快速检测与鉴别在临床医学、食品卫生学、环境科学等领域都具有重要的研究意义。针对致病菌的检测方法有多种，包括常规使用的需细菌培养和形态特征比较的传统生化实验，该检测方法结果虽然准确但费时费力，无法为临床治疗争取时间，很难满足快速检测的需求。基于分子生物学的检测技术，如聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)技术，这些方法均能在短时间内获得结果。但PCR技术由于操作易污染，很难避免假阳性结果的产生；ELISA反应中抗体之间可能产生交叉反应，且蛋白质样品保留时间短，这些弊端至今仍未克服。此外，基因芯片检测技术在本领域的应用，尽管表现出了高灵敏度和高特异性，却因为受限于成本昂贵和操作繁复，因此很难应用到实际检测中。因此，亟需一种快速、准确、灵敏度高、特异性强的检测方法。
技术实现思路
鉴于
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，其能解决检测过程繁琐、耗时长且成本昂贵等问题。为了达到上述目的，本专利技术提供一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，所述致病菌为大肠杆菌和福氏志贺氏菌，所述方法包括以下步骤：(Ⅰ)采用上述两种致病菌的质控菌株制作拉曼增强光谱，包括利用拉曼光谱仪扫上述两种致病菌的质控菌株，以得到拉曼增强光谱，其中描拉曼光谱仪的扫描参数：激光功率为200mw，激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400～1800cm-1，积分时间为5-20s，分辨率为4cm-1；(Ⅱ)利用拉曼光谱仪扫待检测的食品的样品，以得到样品的拉曼光谱，其中拉曼光谱仪的扫描参数与步骤(Ⅰ)一致；(III)将实际样品的拉曼光谱与质控菌株的拉曼光谱进行比对，即根据拉曼光谱的特征峰峰位与强度进行定性识别，或者对实际样品和质控菌株的图谱中的600-1500cm-1波段进行主成分分析与聚类分析得到拉曼光谱对应的判别散点分布图，然后比较这些判别散点分布图来判断食品中是否存在这两类致病菌；大肠杆菌的特征峰包括646cm-1、827cm-1、870cm-1、989cm-1、1059cm-1、1230cm-1、1312cm-1、1439cm-1；福氏志贺氏菌的特征峰包括651cm-1、863cm-1、979cm-1、1010cm-1、1166cm-1、1242cm-1、1340cm-1、1446cm-1。在根据本专利技术所述的一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法中，在步骤(I)之前，还包括质控菌株样品的制备。在根据本专利技术所述的一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法中，所述制备包括合成拉曼增强试剂、制备细菌培养基以及菌悬液的制备。在根据本专利技术所述的一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法中，主成分分析采用的软件为SPSS。合成拉曼增强试剂的具体操作过程为：取10mL氯金酸溶液至圆底烧瓶中，加热搅拌至溶液微沸，然后加入1mL浓度为2％的柠檬酸三钠溶液，继续保持微沸3min，最后将圆底烧瓶冷却，得到检测用纳米金溶胶颗粒。制备细菌培养基的具体步骤：称取4.3mg的营养肉汤培养基于三角瓶中，加入100ml纯净水后加热溶解至溶液澄清，降温后调节pH值至7.0-7.4，在0.103Mpa，121℃中灭菌15min。配置细菌待测液的过程：将细菌或待测样品接种于培养基中，37℃，100rpm/min震荡培养5hrs，取1-5ml菌液于离心管中，4℃7000rpm/min离心5min，去除上清液加入1ml无菌生理盐水悬浮后再次离心洗涤；以上操作重复三次，得到细菌待测液。制作拉曼光谱过程：取所述纳米金溶胶与所述细菌待测液按照(1-5)∶1混匀后，取100-500μL于样品池中，用于拉曼光谱检测。本专利技术的有益效果：建立利用表面增强拉曼光谱技术进行多种致病菌快速检测与鉴别的方法，两种致病菌的光谱图在数秒内完成；采用SERS图谱进行细菌鉴别，将检测时间缩短到几秒钟，为致病菌的快速检测提供便利方法。附图说明图1为两种不同致病菌的SERS图谱；图2为两种致病菌的主成分分析的散点图；图3为实际样品的拉曼光谱图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案以及优点更清楚、明确，以下将结合具体实施例，对本专利技术进一步详细说明。表面增强拉曼(Surface-EnhancedRamanScattering，简称SERS)，用通常的拉曼光谱法测定吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品，或吸附在这些金属片的粗糙表面上的样品。表面增强拉曼光谱技术(SERS)借助增强基底吸附在细菌细胞表面使原本的拉曼信号得到106～1015倍的增强，具备更高的信噪比和灵敏度的同时，采集到更多致病菌的特征信息，显示出不同菌株间更加细微的差异。利用SERS技术可检测不同的致病菌，凭借其检测图谱较低的谱带重叠和数据叠加，以及丰富的信息含量，获得“独一”的致病菌全生物指纹图谱用于识别两种致病菌；结合多元统计分析方法(Multivariatestatisticalanalysis，MVA)辅助结果判定，排除肉眼观察时主观判断上的误差，使致病菌的鉴别更加准确可靠。制作两种致病菌的拉曼图谱的过程：拉曼增强试剂的合成：吸取10mL氯金酸溶液至圆底烧瓶中，利用恒温加热磁力搅拌器加热搅拌至溶液微沸，然后加入1mL浓度为2％的柠檬酸三钠溶液，继续保持微沸3min，最后将圆底烧瓶置于冰水浴中搅拌冷却，呈酒红色，得到检测用纳米金溶胶颗粒。培养基的配置：称取4.3mg的营养肉汤培养基于三角瓶中，加入100ml纯净水后加热溶解至溶液澄清，降温后调节pH值至7.2±0.2，0.103Mpa，121℃灭菌15-20min，备用。细菌样品的制备：将甘油保藏的菌种迅速融化，用接种环粘取接种于培养基中，37℃，100rpm/min震荡培养1-6hrs，取1ml菌液于离心管中，4℃7000rpm/min离心5min，去除上清液加入1ml无菌生理盐水悬浮后再次离心洗涤，得到待测液。得出拉曼光谱图：采用便携式表面增强拉曼光谱仪进行检测，设置常数如下：激光功率为200mw，激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400～1800cm-1，积分时间为5-20s，分辨率为4cm-1。取纳米金溶胶与样品按照(1-5)∶1混匀后，立即检测，收集拉曼光谱图(如图1所示)。图中曲线1表示的是大肠杆菌、曲线2表示的是福氏志贺氏菌。通过SERS检测发现，大肠杆菌和福氏志贺氏菌的拉曼振动峰的位置和强度区别明显，比较两种菌株的SERS平均图谱，两种菌株在600-800cm-1，900-1100cm-1，1150-1430cm-1波段的SERS图谱存在明显差别，截取600-1500cm-1波段进行提取主成分分析(PCA)，提取出2个PC得分因子，是以累积贡献率大于70％的PC1和PC2作散点图和判别分析，模型具有较好的预测能力。用该模型辨别实验菌株，各组具有100％的灵敏度和大于94％的特异性，说明在实际检测中，该模型的低漏判率和错判率能够得到十分可靠的判别结果，可以用于大肠杆菌和福氏志贺氏菌的鉴别及区分。在用统计分析方法研究多变量的课题时，变量个数太多就会增加课题的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，所述致病菌为大肠杆菌和福氏志贺氏菌，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(Ⅰ)采用上述两种致病菌的质控菌株制作拉曼增强光谱，包括利用拉曼光谱仪扫上述两种致病菌的质控菌株，以得到拉曼增强光谱，其中描拉曼光谱仪的扫描参数：激光功率为200mw，激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400～1800cm

【技术特征摘要】
1.一种利用拉曼增强光谱检测食品中致病菌的方法，所述致病菌为大肠杆菌和福氏志贺氏菌，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(Ⅰ)采用上述两种致病菌的质控菌株制作拉曼增强光谱，包括利用拉曼光谱仪扫上述两种致病菌的质控菌株，以得到拉曼增强光谱，其中描拉曼光谱仪的扫描参数：激光功率为200mw，激发光波长为785nm，扫描光谱范围为400～1800cm-1，积分时间为5-20s，分辨率为4cm-1；(Ⅱ)利用拉曼光谱仪扫待检测的食品的样品，以得到样品的拉曼光谱，其中拉曼光谱仪的扫描参数与步骤(Ⅰ)一致；(III)将实际样品的拉曼光谱与质控菌株的拉曼光谱进行比对，即根据拉曼光谱的特征峰峰位与强度进行定性识别，或者对实际样品和质控菌株的图谱中的600-1500cm-1波段进行主成分分析与...

【专利技术属性】
技术研发人员：易鹏，张萍，郑大威，刘晓莹，林太凤，王惠琴，肖志勇，
申请(专利权)人：北京芥微科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11