基于超支化纳米结构的表面增强拉曼生物分子检测方法技术

本发明专利技术属于生物分子检测技术领域，具体为一种基于超支化纳米结构的定量表面增强拉曼生物分子检测方法。首先在小粒径纳米金属球表面组装一层DNA支架分子及拉曼小分子(I)。然后以该DNA支架分子为模板，在金属球内核表面生成一定厚度的带有枝杈的金属球壳，最后在金属球壳表面修饰上拉曼小分子(II)及相应的探针分子。利用待测物与探针分子的特异性结合作用牵引超支化纳米结构的纳米粒子聚集，然后检测两种拉曼小分子的拉曼信号。通过内标法与比值法联用实现对待测物的特异性定量检测。本发明专利技术操作简单、快捷、灵敏，可实现对生物分子的超灵敏特异性定量检测，可广泛用于食品安全检测、医学诊断、法医检验等领域，具有重要的应用前景和开发价值。

Surface enhanced Raman biological molecular detection method based on hyperbranched nanostructure

The invention belongs to the field of biomolecule detection technology, in particular to a quantitative surface enhanced Raman biological molecule detection method based on hyperbranched nano structure. Firstly, a group of DNA support molecules and Raman small molecules (I) are assembled on the surface of a small diameter nano metal sphere. And then using the DNA stent as template molecules, with branches of the metallic shell generated in a certain thickness of metal ball core surface, the metal shell surface modification on Raman small molecule (II) and the corresponding probe molecules. Using the specific binding between the probe and the probe molecules, the nanoparticles of the hyperbranched nano structure are aggregated and then the Raman signals of two kinds of Raman small molecules are detected. By means of internal standard method and ratio method, the specific quantitative detection of the analytes was achieved. The invention has the advantages of simple operation, quick and sensitive, can realize ultra sensitive and specific quantitative detection of biological molecules, can be widely used in food safety detection, medical diagnosis, forensic examination and other fields, has important application prospect and the development value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分子检测
，具体涉及一种基于超支化纳米结构的定量表面增强拉曼生物分子检测方法。
技术介绍
要对低浓度的生物分子，诸如蛋白质、肽、寡核苷酸、核酸、酯类、多糖、激素、神经递质、代谢物等进行灵敏且准确的检测，鉴定和/或定量是一项困难的任务，但是它们在医疗诊断、病理学、毒理学、流行病学、生物战、环境取样、法医学和其它大量领域具有广泛而潜在的应用。这就要求我们的检测器件必须逐步微型化，同时也要保证检测的高效和灵敏度，这是目前许多传统的生物分析方法所面临的极大挑战。表面增强拉曼散射(SERS:SurfaceEnhancedRamanScattering)技术由于其具有极高检测灵敏度、可猝灭荧光、非破坏性指纹式的分辨能力等许多优点，被广泛应用于表面研究、生物大分子的界面取向及构型、构象分析、痕量与微量检测，甚至可以进行单分子检测。而现有的纳米技术很难得到均匀SERS增强的耦合的纳米溶胶或者纳米基底，使得分子信号的放大倍数难以达到一致，因此无法用所检测到的分子信号来得到分子浓度，即无法实现特异性定量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是运用表面拉曼光谱方法，利用待测物与探针分子的特异性结合作用牵引超支化纳米金属颗粒聚集，然后直接检测两种拉曼小分子的拉曼信号。利用内标作为参比，外标标记待测物，利用两者的比值真实有效的反应待测物所处的物理化学环境，从而实现对生物分子进行特异性和定量化检测。本专利技术应用表面拉曼光谱方法实现对生物分子进行超灵敏特异性和定量化检测，在食品安全检测、医学诊断、法医检验等领域，具有重要的应用前景和开发价值。本专利技术通过以下技术方案实现：一种基于超支化纳米结构的定量表面增强拉曼生物分子检测方法，包括以下步骤：(1)超支化纳米结构SERS探针的制备：①制备粒径均匀的纳米金属球作为内核；②在内核表面组装上第一单分子层，所述第一单分子层由DNA分子和拉曼小分子(I)组成；③在第一单分子层表面生长一层带有枝杈的金属球壳；④将探针分子和拉曼小分子(II)修饰到金属球壳表面；具体地为，首先制备粒径均匀的小粒径纳米金属球作为内核，然后在内核表面组装上第一单分子层(由DNA支架分子和内标拉曼小分子(I)组成)，接着在第一单分子层表面生长一层带有枝杈的金属球壳，最后将相应的探针分子和外标拉曼小分子(II)修饰到带有枝杈的金属球壳表面，形成超支化纳米结构SERS探针，所述超支化纳米结构SERS探针为核壳结构金属纳米颗粒SERS探针。其中，金属球包括金纳米粒子、银纳米粒子、铜纳米粒子，所述小粒径纳米金属球是指10～30nm的金属球；其中，所述DNA支架分子的一端具有一段重复的腺嘌呤(Adeninephosphate：A)，其他含有巯基末端、氨基末端或者羧基末端的强吸附分子可以替换。其中，所述纳米金属球包括金纳米粒子、银纳米粒子、铜纳米粒子，粒径为10～30nm。其中，所述DNA分子的序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACAAGAGTTACTAGTCTCGTCGGAGTCGTATCGCTACAAGTCC-3’。其中，所述“带有枝杈的金属球壳”是指由金纳米粒子或银纳米粒子或者铜纳米粒子，其表面有凸起，其形状类似花瓣。其中，所述金属球壳的粒径为20～300nm。其中，所述拉曼小分子(I)/(II)选用含有巯基末端、氨基末端或者羧基末端的强吸附且有强拉曼散射截面的分子；如4-巯基苯甲酸(4-MBA)、4-巯基吡啶(4-MPY)、5,5'-－二硫二硝基苯甲酸(DTNB)、4,4'-联吡啶(4,4'--DP)、1，2-二(4-吡啶基)乙烯(1,2-BE)、酞嗪(PHTH)等；金属球壳的内外表面各修饰了一种拉曼小分子，且两种拉曼小分子的特征峰不重合。其中，所述探针分子可以选自以下：组1：探针1:5’-AAAAAAAAAATTTTTATgATgTTCgTTgTg-3’探针2:5’-gTgTTTAggATTTgCTTTTTAAAAAAAAAA-3’；或，组2：探针1:5’-AAAAAAAAAAAACTATGCAA-3’探针2:5’-CCTACTACCTCTAAAAAAAAAA-3’；或，组3：探针1:5’-AAAAAAAAAAAAACCTGGGGGAGT-3’探针2:5’-ATTGCGGAGGAAGGTAAAAAAAAAAAA-3’；或，组4：探针1:5’-AAAAAAAAAAAAAGCAACCTCAAA-3’探针2:5’-CAGACACCATGGAAAAAAAAAAAA-3’。(2)待测物与超支化纳米结构的SERS探针的组装：在室温下将上述表面修饰有不同探针分子的核壳结构金属纳米颗粒SERS探针混合，用pH＝7.4、浓度为10mM的PB缓冲液调节体系的酸碱度,使得整个反应体系在中性环境中进行，加入设计好的等体积的不同浓度的待测物，摇匀使核壳结构金属纳米颗粒SERS探针与待测物充分结合，形成待测物与核壳结构金属纳米颗粒SERS探针结合的水溶液(或溶胶)。(3)SERS检测：准备激光检测，测量待测物与超支化纳米结构的SERS探针结合的水溶液(或溶胶)，统计加入不同浓度梯度的待测物后，两种拉曼小分子的特征峰强度，并求出拉曼小分子(Ⅱ)与拉曼小分子(Ⅰ)的特征峰比值，找出所求出的特征峰比值与待测物浓度的关系。通过内标法与比值法联用实现对待测物的特异性定量检测。其中，所述激光检测的条件为激光选用780nm，曝光时间2秒，拉曼位移200-3500cm-1。将上述实验得到的信号与标准曲线比较，得到待测物的含量。在一个具体的实施方式中，检测DNA:5’-gCAAATCCTAAACACCACAACgAACATCAT-3’时，标准曲线方程为IR＝0.0293C+2.1216(线性相关系数R＝0.9848)。在一个具体的实施方式中，检测let7家族的RNA，特异性识别let7家族的RNA效果显著，p<0.05。let7家族的RNA为：let7a:5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’let7b:5’-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3’let7c:5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’let7d:5’-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3’let7e:5’-UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU-3’let7f:5’-UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU-3’let7g:5’-UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU-3’let7i:5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU-3’miR98:5’-UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU-3’mirR21:5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。在一个具体的实施方式中，检测ATP时的标准曲线方程为IR＝0.0352C+1.83067(线性相关系数R＝0.95717)。在一个具体的实施方式中，检测可卡因时的标准曲线方程为IR＝0.02746C+3.17406(线性相关系数R＝0.99417)。本专利技术提供了一种基于超支化纳米结构的材料，其结构的特殊性具有克服现有SERS特异性定量瓶颈问题的能力，其原理是：在具有高SERS活性的金属(如金、银、铜等)纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于超支化纳米结构的定量表面增强拉曼生物分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)超支化纳米结构的SERS探针的制备：①制备粒径均匀的纳米金属球作为内核；②在内核表面组装上第一单分子层，所述第一单分子层由DNA分子和拉曼小分子(I)组成；③在第一单分子层表面生长一层带有枝杈的金属球壳；④将探针分子和拉曼小分子(II)修饰到金属球壳表面；(2)待测物与超支化纳米结构的SERS探针的特异性结合；(3)SERS检测：检测待测物与超支化纳米结构的SERS探针特异性结合，统计拉曼小分子(Ⅰ)与拉曼小分子(Ⅱ)的特征峰强度；求出拉曼小分子(Ⅱ)与拉曼小分子(Ⅰ)的特征峰比值，找出所求出的特征峰比值与待测物浓度的关系，通过内标法及比值法联用与标准曲线相比较，得到待测物的含量。

【技术特征摘要】
1.一种基于超支化纳米结构的定量表面增强拉曼生物分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)超支化纳米结构的SERS探针的制备：①制备粒径均匀的纳米金属球作为内核；②在内核表面组装上第一单分子层，所述第一单分子层由DNA分子和拉曼小分子(I)组成；③在第一单分子层表面生长一层带有枝杈的金属球壳；④将探针分子和拉曼小分子(II)修饰到金属球壳表面；(2)待测物与超支化纳米结构的SERS探针的特异性结合；(3)SERS检测：检测待测物与超支化纳米结构的SERS探针特异性结合，统计拉曼小分子(Ⅰ)与拉曼小分子(Ⅱ)的特征峰强度；求出拉曼小分子(Ⅱ)与拉曼小分子(Ⅰ)的特征峰比值，找出所求出的特征峰比值与待测物浓度的关系，通过内标法及比值法联用与标准曲线相比较，得到待测物的含量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述DNA分子的序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACAAGAGTTACTAGTCTCGTCGGAGTCGTATCGCTACAAGTCC-3’。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述纳米金属球包括金纳米粒子、银纳米粒子、铜纳米粒子，粒径为10～30nm。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述带有枝杈的金属球壳是指由金纳米粒子、银纳米粒子或铜纳米粒子，表面有凸起，形状类似花瓣；所述带有枝杈的金属球壳的粒径为20～300nm。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述拉曼小分子(I)、拉曼小分子(II)选用含有巯基末端、氨基末端或者羧基末端的强吸附且有强拉曼散射截面的分子。6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴昊，齐林，瞿祥猛，李丽，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31