一种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法，以氢氟酸浸泡除杂后的单晶硅片，在其表面形成硅-氢键，加入硝酸银制得硅表面增强拉曼散射基底；将发夹DNA末端巯基与银纳米粒子共价形成Ag-S键，使发夹DNA共价连接到银纳米粒子修饰的硅片上，老化后，加入待检测耳聋致病基因序列充分杂交进行SERS检测；本发明专利技术采用发夹DNA辅助的SERS硅基底进行实体中耳聋致病基因的检测，有效提高了拉曼检测灵敏度，降低检测线，具有高特异性，重现性好。该检测方法操作简单，成本低，易于普及和传播。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，以氢氟酸浸泡除杂后的单晶硅片，在其表面形成硅-氢键，加入硝酸银制得硅表面增强拉曼散射基底；将发夹DNA末端巯基与银纳米粒子共价形成Ag-S键，使发夹DNA共价连接到银纳米粒子修饰的硅片上，老化后，加入待检测耳聋致病基因序列充分杂交进行SERS检测；本专利技术采用发夹DNA辅助的SERS硅基底进行实体中耳聋致病基因的检测，有效提局了拉曼检测灵敏度，降低检测线，具有高特异性，重现性好。该检测方法操作简单，成本低，易于普及和传播。【专利说明】-种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法
本专利技术属于生物体外诊断
，涉及一种耳聋基因的检测方法，具体涉及一 种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法。
技术介绍
耳聋是一种最常见的人类感觉系统缺陷，因其病因复杂、发生率高和治疗困难 等原因而长久地困扰着广大患者及其周围人群，极大地影响着人们的相互交流和生活质 量。据统计，重度耳聋在新生儿中发生率高达l/80(Tl/1000 (参见：N. Engl. J. Med. 2006，354，2151-2164)，全世界几乎七千万人罹患55分贝以上的听力减退，70岁以上的 人群中超过60%具有至少25分贝的听力减退(参见：Curr. Opin. Pediatr. 2012，24， 679-686)。 医学界和科研界一直努力探求新的治疗手段，正如恩格斯所说："社会一旦有技 术上的需要，这种需要就会比10所大学更能把科学推向前进。"耳聋基因治疗的研究始于 1996年，近十几年来得益于现代分子生物学、基因工程技术的进步，耳聋基因治疗取得了较 为飞速的发展。传统检测方法主要有聚合酶链式反应、DNA测序、寡核苷酸探针杂交法等， 需要指出的是这些检测方式操作过程繁杂冗长、检测灵敏度较低、仪器设备昂贵，这对于耳 聋突变基因的早期诊断和治疗是极为不利的（参见 ：J. Hum. Genet. 1999，44，388-390; J. Hum. Genet. 2005，117，9-15; Biosci. Rep. 2008，28，49-59)。 表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Scattering，全文简称：SERS)是在 拉曼散射的基础上建立起来的无损分析表征技术。由于其具有谱带窄、分辨率高、水干扰 小、灵敏度高等优点，被广泛应用于化学分析、表面催化、食品安全检测、材料科学和生物医 学诊断等领域。但是，表面增强拉曼光谱技术能否发展成为一种具有实际应用意义的分析 技术，很大程度上取决于表面增强拉曼光谱技术的重现性和稳定性，其中关键之处就是制 备出灵敏度高、重现性好、稳定性高、易制备的表面增强拉曼光谱活性基底并能够在实体检 测中得到广泛应用（参见：Small 2013，9，2493-2499; Nano Today 2011，6，122-130)。 目前，现有技术中，尚无关于采用表面增强拉曼光谱对实际体系中耳聋突变基因 进行高灵敏特异检测的详细报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于开创性的提供一种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋 基因的方法。 为实现上述目的，本专利技术以氢氟酸（HF)浸泡除杂后的单晶硅片，在其表面形成 硅-氢（Si-H)键，加入硝酸银（AgN0 3)制得硅表面增强拉曼散射（SERS)基底；将发夹DNA 末端巯基（SH基）与银纳米粒子（silver nanoparticles，全文简称AgNPs)，使发夹DNA共 价连接到 AgNPs 修饰的 Si 材料（AgNPs-decorated silicon wafers，全文简称 AgNPsOSi) 上，老化后，加入待检测耳聋致病基因序列充分杂交进行SERS检测。 具体的，本专利技术提供如下技术方案： 本专利技术的基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法，包括下述步骤： (1)硅片的预处理 将单晶硅片置于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声清洗，用浓硫酸（H2S04) 和过氧化氢（H202)混合溶液清洗，用氢氟酸溶液浸泡硅片，将硅片平铺于反应器中，光面朝 上，向其中迅速加入不同pH值的硝酸银溶液进行反应，得到表面修饰银纳米颗粒的硅片 SERS基底； 上述技术方案中，将单晶硅片置于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水以60Hz 频率超声清洗15分钟。 上述技术方案中，以体积比=3:1的浓硫酸和30%过氧化氢混合溶液清洗硅片30 分钟。 优选的，所述氢氟酸溶液的浓度为1~30% ; 进一步的，所述氢氟酸溶液浸泡硅片的时间为5~45分钟。 优选的，所述硝酸银溶液浓度为l~5mM，反应时间为5~25分钟。 优选的，用1?30%的氢氟酸溶液或0. 001?5M的NaOH溶液调节硝酸银溶液的pH值。 优选的，用氮气吹干表面，得到硅基SERS基底。 (2)组装发夹结构DNA 将步骤（1)制备的硅基SERS基底与溶解于磷酸盐缓冲液（PBS)的发夹DNA在恒温震荡 仪上混合孵育，向溶液中分次加入氯化钠/磷酸盐溶液，过夜老化； 优选的，所述发夹DNA的最初浓度为l?5uM，反应条件为30(T380rpm，反应温度为 23~28°C，反应时间至少12小时。 优选的，所述氯化钠/磷酸盐溶液最初浓度为广3M，分次加入使组装溶液最终浓 度达到0. 01?1M。 (3)检测实体中耳聋致病基因 取出已组装发夹DNA的材料基底，用PBS溶液洗涤多次，加入系列浓度的待检测耳聋致 病基因序列于恒温振荡仪中进行充分杂交后，用PBS或者无菌去离子水冲洗表面，空气中 自然晾干，进行SERS检测。 优选的，所述的待检测耳聋致病基因序列溶解于杂交缓冲液中，反应条件为 30(T380rpm，杂交温度为30?38°C，杂交时间2?4小时。 本专利技术中，调节和优化硝酸银溶液的pH值可使硅片表面原位生长出的银纳米粒 子尺寸均匀、重现性好且具有很强的SERS效应，克服了传统方法中重现性差的问题，同时 避免了银纳米粒子在普通制作工艺中的团聚效应。本专利技术无需在硅片表面制作硅纳米线， 工艺步骤简单，适合大规模的工业生产及实体检测。基于上述优点的前提下，本专利技术采用发 夹DNA辅助的SERS硅基底进行实体中耳聋致病基因的检测，有效提高了拉曼检测灵敏度， 降低检测线（ΙρΜ)，具有高特异性，重现性好。该检测方法操作简单，成本低，易于普及和传 播。 【专利附图】【附图说明】 为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本专利技术的附图仅仅是本专利技术的一 些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些 附图获得其他的附图。 图1是基于表面增强拉曼散射光谱对耳聋致病基因高效检测的技术示意图； 图2是硅基SERS基底（AgNPsOSi)的扫描电镜和原子力显微镜表征照片； 图3是硅基SERS基底（AgNPsOSi)对实体中耳聋致病基因的灵敏检测SERS光谱图； 图4是硅基SERS基底（AgNPsOSi)对实体中耳聋致病基因的特异检测SERS光谱图； 图5是硅基SERS基底（AgNPsO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于表面增强拉曼光谱检测耳聋基因的方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）将单晶硅片置于超声仪中依次用去离子水、丙酮、去离子水超声清洗，用浓硫酸和过氧化氢混合溶液清洗，用氢氟酸溶液浸泡硅片，将硅片平铺于反应器中，光面朝上，向其中迅速加入不同pH值的硝酸银溶液进行反应，得到表面修饰银纳米颗粒的硅片SERS基底；（2）将步骤（1）制备的硅片SERS基底与溶解于磷酸盐缓冲液的发夹DNA在恒温震荡仪上混合孵育，向溶液中分次加入氯化钠/磷酸盐溶液，过夜老化；（3）取出已组装发夹DNA的材料基底，用磷酸盐缓冲液洗涤多次，加入系列浓度的待检测耳聋致病基因序列于恒温振荡仪中进行充分杂交后，用磷酸盐缓冲液或者无菌去离子水冲洗表面，空气中自然晾干，进行SERS检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何耀，姜享旭，王会，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32