蛋白质构象变化的生物正交拉曼原位检测方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质构象变化的生物正交拉曼原位检测方法，尤其涉及一种使用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质构象变化的方法，其包括如下步骤：a)制备携带生物正交拉曼报告基团的非天然氨基酸；b)利用基因扩展技术，将步骤a)制备的非天然氨基酸插入目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质进行生物正交拉曼报告基团标记；c)利用生物正交拉曼技术对步骤b)得到的蛋白质进行检测。本发明专利技术的方法通过基因密码子扩增技术和SERS增强的方法，灵敏、高效地检测带有生物正交基团的蛋白不同环境条件或者活性条件下其构象的变化，实现了解析溶液和细胞体系中蛋白质构象与功能之间的联系。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质构象变化的生物正交拉曼原位检测方法
本专利技术涉及蛋白质化学和构象变化的检测，尤其涉及一种利用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质，利用生物正交拉曼技术体外检测蛋白构象变化，以及利用生物正交拉曼技术在活细胞原位检测蛋白构象变化的方法。
技术介绍
蛋白质分子的空间构象是其功能、活性的基础。蛋白质对环境和刺激的响应是通过蛋白质或者蛋白复合体其构象的变化进而实现其功能和活性的调节。其中某些重要氨基酸的位置、取向、运动在蛋白质的变构过程中发生显著的变化。因而实现快速、灵敏和高效的检测蛋白质构象变化(特别是在生理条件下原位检测蛋白质的构象变化)对于研究蛋白质结构与功能联系至关重要。目前，研究蛋白结构的方法有很多种，包括X-射线晶体衍射法、核磁共振法、红外光谱法、荧光光谱法、拉曼光谱法、圆二色谱法、质谱法等。这些方法各有利弊和适用的范围。比如，X射线晶体衍射已经发展了几十年，样品不需要标记，分子量没有限制，数据采集和分析相对成熟，它能够提供原子分辨率的蛋白质结构；但是X射线晶体衍射法要求对分析蛋白质的晶体(制备蛋白质单晶是很复杂和困难的)，且要求样品量大、费时、灵敏度差，适合稳态、易于获得晶体的蛋白，对于溶液中的、瞬时的构象变化难以适用。红外光谱法灵敏度低(在组分分析中要求含量一般应大于0.1％)，受水的信号干扰严重，后来发展的近红外技术也未能解决该问题，使得红外光谱法无法用于接近生理环境的体系。核磁共振法、质谱法、荧光光谱法和拉曼光谱法目前能够检测溶液中的蛋白质构象变化。但核磁共振法仅适合于分子量小于40kDa的样品，灵敏度低，分析浓度通常需要达到mM级，且数据处理复杂，分析成本高。质谱法可根据电荷价态分布来研究蛋白质构象，灵敏度高、能够实时监测和定量分析，但常用的ESI-MS以及改进了的冷喷雾电离CSI-MS等，均是进行气态化离子的分析检测，所给出的信息不能十分准确地表征蛋白质在溶液中的真实构象。荧光法中应用较多的是荧光共振能量转移法(FRET)，需要引入较大体积的供体和受体，对蛋白结构和功能会产生一定影响，并且荧光法也有较强的运用现在(比如FRET的效果在10nm范围内是比较灵敏的，超出该限制条件就很难适用了)。相反，拉曼光谱法简单易行，不受水的干扰，无需对被测样品作标记及特殊制备，能够提供物质的分子组成和结构等样品内在的信息，获得丰富的指纹谱峰，已经在细胞、组织甚至活体中得到了应用。但是传统基于拉曼光谱的检测方法，其灵敏度较低，且天然生物分子的谱峰重叠、干扰严重，严重限制了拉曼法的进一步应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的难题，提供一种利用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法。为了提高拉曼光谱法的灵敏度，近年来研究者发展了各种增强技术，如表面增强拉曼(SERS)。SERS是Au、Ag等金属表面对于拉曼信号的一种增强现象，一般可以实现106-1012的增强效果，可达到与荧光光谱相近的灵敏度。另一方面，为了解决生物分子的拉曼谱峰重叠的问题，申请人的专利技术人研究了正交拉曼标签标记的策略，即在生物分子上引入拉曼信号正交基团(如炔基、叠氮、C-D等)，它们的拉曼信号在细胞拉曼信号的沉默区(1800-2800cm-1)。为达到上述目的，本专利技术的使用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法，包括如下步骤：a)制备携带生物正交拉曼报告基团的非天然氨基酸；b)利用基因扩展技术，将步骤a)制备的非天然氨基酸插入目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质进行生物正交拉曼报告基团标记；c)利用生物正交拉曼技术对步骤b)得到的蛋白质进行检测。优选地，上述生物正交拉曼报告基团为炔基、叠氮、氰基或碳氘键。优选地，上述方法还包括利用金纳米离子的表面增强效应。优选地，利用金纳米离子的表面增强效应中的金纳米颗粒AuNPs通过采用柠檬酸钠还原法制备。优选地，柠檬酸钠还原法中所用的HAuCl4的终浓度为0.25mM，柠檬酸钠的终浓度为0.01％(w/w)。优选地，上述使用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法还可包括增加蛋白与AuNPs的亲和力。进一步优选地，上述增加蛋白与AuNPs的亲和力包括使用含半胱氨酸的标签、含甲硫氨酸的标签或蛋白化学修饰上含巯基的小分子。本专利技术的另一目的是提供一种使用生物正交拉曼技术体外检测蛋白构象变化的方法，包括如下步骤：a)在不同溶液条件下，利用上述使用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法来检测蛋白质构象变化；b)在基于步骤a)检测蛋白质构象变化的基础上，研究蛋白质构象变化和环境改变关系。本专利技术的又一目的是提供一种使用生物正交拉曼技术在活细胞原位检测蛋白构象变化的方法，包括如下步骤：a)利用上述使用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法检测活细胞表面的蛋白质构象变化；b)在基于步骤a)检测蛋白质构象变化的基础上，在活细胞层面上，原位研究蛋白质构象变化和其蛋白质活性受刺激调节的关系。优选地，上述刺激包括生长因子刺激、配体刺激或环境改变刺激。本专利技术中使用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法，利用基因扩展技术和携带生物正交拉曼报告基团(包含但不仅限于炔基、叠氮、氰基、碳氘键等)的非天然氨基酸技术实现对目标蛋白质进行生物正交拉曼报告基团标记的方法。利用金纳米离子的表面增强效应，实现在溶液中检测特定蛋白质上生物正交拉曼报基团的方法。该方法具备高效、灵敏和目标蛋白质特异性。利用生物正交拉曼标记结合金纳米离子表面增强效应，实现在活细胞层面上检测特定蛋白质的方法。该方法生物相容性好，操作简单，且兼具高效、灵敏和目标蛋白质特异性。本专利技术还提供了使用生物正交拉曼策略体外检测蛋白构象变化的方法；使用炔基等生物正交拉曼报告基团，结合金纳米离子表面增强效应，在不同溶液条件下，检测蛋白质构象变化的方法；在基于生物正交拉曼检测蛋白质构象变化的基础上，研究蛋白质构象变化和环境改变关系的新方法。使用含半胱氨酸的标签增加蛋白与AuNPs的亲和力，当然包括其他增加亲和力的方法用于SERS增强的生物正交Raman策略检测蛋白局部构象变化，包含但不仅限于含甲硫氨酸的标签或蛋白化学修饰上含巯基的小分子。本专利技术还提供了使用生物正交拉曼策略在活细胞原位检测蛋白构象变化的方法；使用炔基等生物正交拉曼报告基团，结合金纳米离子表面增强效应，检测活细胞表面蛋白质构象变化的方法；在基于生物正交拉曼检测蛋白质构象变化的基础上，在活细胞层面上，原位研究蛋白质构象变化和其蛋白质活性受刺激(生长因子、配体和环境改变等)调节的新方法。本专利技术提供的利用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法，利用生物正交拉曼技术体外检测蛋白构象变化的方法，以及利用生物正交拉曼技术在活细胞原位检测蛋白构象变化的方法，通过基因密码子扩增技术和SERS增强的方法，实现快速、灵敏和高效地检测带有生物正交基团的蛋白质在不同的微环境或活性条件下其构象的变化，特别是实现活细胞上蛋白质构象变化的原位检测，进而解析蛋白质构象与功能之间的联系。该技术基于在蛋白质某特定位点引入生物正交拉曼报告基团的方法和拉曼基团的分子振动信号对微环境改变非常敏感并随环境的变化会发生偏移的理论基础，实现对溶液中蛋白构象本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)制备携带生物正交拉曼报告基团的非天然氨基酸；b)利用基因扩展技术，将步骤a)制备的非天然氨基酸插入目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质进行生物正交拉曼报告基团标记；c)利用生物正交拉曼技术对步骤b)得到的蛋白质进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种使用生物正交拉曼报告基团特异性标记、检测蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)制备携带生物正交拉曼报告基团的非天然氨基酸；b)利用基因扩展技术，将步骤a)制备的非天然氨基酸插入目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质进行生物正交拉曼报告基团标记；c)利用生物正交拉曼技术对步骤b)得到的蛋白质进行检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物正交拉曼报告基团为炔基、叠氮、氰基或碳氘键。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括利用金纳米离子的表面增强效应。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述利用金纳米离子的表面增强效应中的金纳米颗粒AuNPs通过采用柠檬酸钠还原法制备。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，柠檬酸钠还原法中所用的HAuCl4的终浓度为0.25mM，柠檬酸钠的终浓度为0.01％(w/w)。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈兴，李娅娅，洪森炼，林亮，肖明，杜逸飞，
申请(专利权)人：北京大学，陈兴，
类型：发明
国别省市：北京,11