一种数字PCR检测装置与检测方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种数字PCR检测装置与检测方法，所述检测装置包括检测腔、图像传感器、PCB板和耦合器；检测腔位于图像传感器的表面；图像传感器和PCB板相连，检测腔上有分别用于数字PCR微液滴导入和导出的入口和出口。所述检测方法具体为：将数字PCR体系封装成为微液滴阵列，进行扩增反应；反应完成后，将微液滴阵列注入检测腔；待微液滴充满检测腔并成单层排列的时候，激发光源通过耦合器导入平面波导板，发出的荧光通过滤色片，被图像传感器收集成像；在平面波导板上方对照明；计算机比对分析两次图像，得到模板DNA的数量。本发明专利技术采用无透镜成像设计，检测装置的体积大大缩小，方便室外或者便携式应用。

【技术实现步骤摘要】
一种数字PCR检测装置与检测方法
本专利技术涉及聚合酶链反应检测，具体为一种数字PCR检测装置与检测方法。
技术介绍
数字PCR(digitalPCR，dPCR)是将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。与定量PCR不同的是，数字PCR不依赖于CT值，因此不受扩增效率影响，扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算样品的原始浓度或者含量。由于数字PCR能够将误差控制在5％以内，因此，可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析。数字PCR的提出至今虽然只有20年时间，但是由于其独特的技术优势和应用前景，使得其产业化发展相当迅速。迄今为止，基于分液方式的不同，数字PCR技术主要有三类：微反应室/孔板、大规模集成微流控芯片和液滴数字PCR系统。分别通过微孔板、微流体芯片或微液滴实现分液，分隔开的每个微小区域都可进行单独的PCR反应。已有包括Thermo、Fluidigm和Bio-Rad等几家公司相继推出了数字PCR产品，并已经应用于基因拷贝数变异、感染检测、基因测序、基因突变检测等研究领域。PCR的定量检测依靠空的微液滴或者微反应室占比来实现，因此尽可能的提高分液数量可以降低采样误差和分液误差，从而提高检测精度，但是提高分液数量对检测设备造成了一定的困难。现有的PCR检测装置一般依赖图像检测，也有液滴数字PCR系统利用流式细胞仪进行检测的方式。在成像检测中，传统的成像光学通过透镜进行成像，加上还需要荧光成像，所以不可以避免的要使用滤色片和二向色镜组成的滤色块，以及镜头和CCD/CMOS。这导致检测装置的体积较大，且成像范围有限，一般需要对数字PCR芯片进行扫描或者多次成像拼接，成像速度和成本较高。采用流式细胞仪对液滴进行一个一个计数的话的检测成本仍然很高。并且仪器体积一般较大，这对实验室空间要求较高，也不适合野外、即时检测等便携式或者小型化应用需求。。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术目的是提供一种基于图像传感器的无透镜小型化的数字PCR检测装置，本专利技术的另一目的是提供一种成本低、无需透镜、检测面积大的数字PCR检测装置的检测方法。技术方案：本专利技术所述的一种数字PCR检测装置，包括检测腔、图像传感器、PCB板和耦合器；检测腔位于图像传感器的表面；图像传感器和PCB板相连，检测腔上有分别用于数字PCR微液滴导入和导出的入口和出口，出口在微液滴导入过程中开口于空气，以保持检测腔内的气压平衡，检测腔的上表面为平面波导板，下表面为滤色片，内部有PCR扩增产物的微液滴；耦合器用于将激发光源导入平面波导板中。微液滴的粒径在2～200微米。微液滴在检测腔内呈单层排列。微液滴可以在反应完毕后利用注射器通过入口导入检测腔，也可以经由与入口连接的管道通过出口的负压吸入检测腔。PCB板与计算机相连，PCB板包含ADDA模块、FPGA模块和电压控制模块，PCB板用于收集图像传感器的信号。平面波导板为高折射率的透明玻璃板或者聚合物板。图像传感器为CCD或者CMOS图像传感器。图像传感器的像素尺寸小于微液滴粒径的一半，以利于提高成像分辨率。检测腔的下表面为超薄玻璃片或者聚合物片，检测腔的下表面与表面含有滤色片的图像传感器贴合。滤色片的数量为一个或多个，分别用于一种荧光染料或者多种荧光染料的检测。上述数字PCR检测装置的检测方法，包含以下步骤：a、用微流控液滴发生器将数字PCR体系封装成为2～200微米的微液滴阵列，然后在PCR检测装置内进行扩增反应；b、反应完成后，通过检测腔的入口将微液滴阵列注入检测腔，保持检测腔的出口与空气联通，以维持检测腔内的压力平衡；c、待微液滴充满检测腔并成微液滴阵列的时候，激发光源通过耦合器导入平面波导板，发出的荧光通过滤色片，被图像传感器收集成像，激发光为LED光源、激光光源或汞灯光源；d、在平面波导板上方直接对微液滴阵列进行照明，使微液滴在图像传感器的表面成像；e、计算机把通过数据采集PCB板采集的两次图像进行比对分析，计算得到模板DNA的数量。工作原理：激发光通过耦合器进入平面波导板内，包含有PCR反应产物的微液滴与平面波导板接触，当微液滴大小大于或者等于检测腔腔体高度的时候，波导板内激发光的消逝波将会进入微液滴内部，从而激发反应产物的荧光分子发出荧光。由于发光的微液滴与图像传感器的距离非常近，在微米级别，同时微液滴的表面为弯曲表面，具有光聚焦功能，因此发光液滴可以在图像传感器表面直接形成一个亮点。当微液滴与检测腔上表面不接触的时候，激发光可以垂直穿过平面波导片直接激发微液滴内的荧光分子发出荧光，由于微液滴具有透镜的作用，所以可以直接在图像传感器表面形成图像。通过以上两种方式，检测腔内的微液滴可以被成像在图像传感器上。有益效果：本专利技术和现有技术相比，具有如下显著性特点：1、采用无透镜成像设计，因此检测装置的体积大大缩小，可以做成便携式装置，方便室外或者便携式应用；2、空间带宽积可以不受传统透镜成像的限制，能够成大面高分辨率的图像，对于数字PCR微米尺寸的微液滴进行大面积成像，大大降低了传统透镜的扫描成像成本；3、采用大靶面图像传感器，可以对几百万甚至几千万和上亿的微液滴进行成像分析，高的分液数量可以降低采样误差和分液误差，从而进一步提高检测精度。附图说明图1是本专利技术实施例1的主视图；图2是本专利技术实施例1的俯视图；图3是本专利技术实施例2的主视图。具体实施方式实施例1如图1～2，检测腔1的腔高度为15微米，检测腔1上有入口6和出口7，检测腔1的上表面，即平面波导板4为高折射率的透明玻璃板，下表面为滤色片5，厚度为1微米。滤色片5贴合于图像传感器2的表面，图像传感器2为1.2英寸黑白CMOS，像素数为2048(H)x2048(V)，像素尺寸6.5x6.5(μm)。用于收集图像传感器2信号的PCB板3与计算机相连，PCB板3包含ADDA模块、FPGA模块和电压控制模块。采用微流控液滴发生器将含有SYBRGreenI荧光探针的常规数字PCR体系封装成为15微米的微液滴8阵列，然后在PCR仪内进行扩增反应。反应完成后，通过检测腔1入口6将微液滴8阵列注入检测腔1，保持检测腔1的出口7与空气联通，以维持检测腔1内的压力平衡。待微液滴8充满检测腔1并成单层排列的时候，采用波长为497nm的LED激发光源，通过耦合器9导入平面波导板4，由于平面波导板4与微液滴8接触，所以激发光的消逝场会耦合进入微液滴8，激发微液滴8内的荧光染料，发出的荧光通过510nm的一个带通滤色片5，被CMOS图像传感器2收集成像。然后，通过1.2英寸白光LED面板在平面波导板4上方直接对微液滴8阵列进行照明，使微液滴8在CMOS图像传感器2的表面成像。计算机把通过数据采集PCB板3采集的两次图像进行比对分析，得到无荧光空白液滴所占总液滴数目的比例从而计算得到模板DNA的数量。实施例2如图3，检测腔1的腔高度为8微米，检测腔1上有入口6和出口7，检测腔1的上表面，即平面波导板4为高折射率的聚合物板，下表面为聚合物板，厚度为1微米。检测腔1的下表面与表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种数字PCR检测装置，其特征在于：包括检测腔(1)、图像传感器(2)、PCB板(3)和耦合器(9)；所述检测腔(1)位于图像传感器(2)的表面；所述图像传感器(2)和PCB板(3)相连，所述检测腔(1)上有入口(6)和出口(7)，所述检测腔(1)的上表面为平面波导板(4)，下表面为滤色片(5)，内部有PCR扩增产物的微液滴(8)；所述耦合器(9)用于将激发光源导入平面波导板(4)中。

【技术特征摘要】
1.一种数字PCR检测装置，其特征在于：包括检测腔(1)、图像传感器(2)、PCB板(3)和耦合器(9)；所述检测腔(1)位于图像传感器(2)的表面；所述图像传感器(2)和PCB板(3)相连，所述检测腔(1)上有入口(6)和出口(7)，所述检测腔(1)的上表面为平面波导板(4)，下表面为滤色片(5)，内部有PCR扩增产物的微液滴(8)；所述耦合器(9)用于将激发光源导入平面波导板(4)中。2.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置，其特征在于：所述微液滴(8)的粒径在2～200微米。3.根据权利要求1或2所述的一种数字PCR检测装置，其特征在于：所述微液滴(8)在检测腔(1)内呈单层排列。4.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置，其特征在于：所述PCB板(3)与计算机相连，所述PCB板(3)包含ADDA模块、FPGA模块和电压控制模块。5.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置，其特征在于：所述平面波导板(4)为透明玻璃板或者聚合物板。6.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置，其特征在于：所述图像传感器(2)为CCD或者CMOS图像传感器(2)。7.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置，其特征在于：所述图像...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵祥伟，葛芹玉，朱纪军，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32