致耐受性DNA疫苗制造技术

本发明专利技术涉及用于耐受免疫，特别是用于预防和/或延迟例如1型糖尿病的编码胰岛素抗原和细胞因子的质粒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】致耐受性DNA疫苗
本专利技术涉及用于降低抗原特异性T细胞反应性的致耐受性DNA免疫治疗疫苗。
技术介绍
根据传统的疫苗方法，将纯化的蛋白质/抗原注射到人/患者/动物体内，以刺激特异性针对该蛋白质/抗原的免疫应答。这种疫苗方法往往主要影响抗体产生，而T细胞往往不会受到显著影响，除了生成抗原的T细胞记忆外。因此，传统的疫苗方法被认为不适合于治疗和/或预防T细胞驱动的疾病，例如1型糖尿病(T1D)，因为T细胞，特别是CD8+T细胞的激活被认为是该疾病的致病原因。使用致耐受性的、基于蛋白质的疫苗的实验方法主要针对产生抗体的B细胞，而不是疾病相关的T细胞。与基于蛋白质的疫苗相比，基于DNA的疫苗通常是编码特定抗原的质粒—这些质粒被宿主体内的细胞摄取(“转染”)。然后这些转染的宿主细胞产生抗原，并将该抗原加工成小片段(T细胞表位)以呈递给免疫系统，特别是呈递给循环T细胞。由于T细胞只能检测这些小抗原片段而不能检测完整的蛋白质，因此该方法优先导致T细胞应答的改变，特别是针对CD8+T细胞(或细胞毒性T细胞)—例如T1D病理学的关键驱动因素。因此，DNA疫苗适合于诱导T细胞应答，而蛋白质疫苗则不适合。虽然目前没有可用于人类的DNA疫苗，但有三种刺激性质粒DNA疫苗被许可用于兽医用途：诱导对马传染性贫血病毒、西尼罗病毒和某些犬癌症的免疫。与刺激性DNA疫苗相反，致耐受性DNA免疫治疗疫苗旨在抑制针对抗原的免疫反应性，而不是激活针对该抗原的免疫应答。这些疫苗不刺激针对所编码的抗原的免疫，或者不改变刺激的类型(像例如针对变态反应的抗原脱敏接种方法一样)，而是导致自身反应性T细胞的消耗和/或功能缺乏和/或死亡。为了做到这一点，必须将抗原呈递给免疫系统而没有共刺激或炎症效应，否则其将引发刺激性免疫应答。这种呈递会被免疫系统忽视或耐受的抗原的方法在治疗自身免疫性疾病中可能是有价值的，因为将会针对该疾病的特定机制，而不是全身性地抑制整个免疫应答。因此，致耐受性DNA免疫治疗疫苗是调节不希望的免疫应答的温和方法。T1D特异性致耐受性DNA免疫治疗疫苗的最终目标是保持β细胞功能和内源性胰岛素产生。这可以通过以下手段来发生：预防或延迟疾病(在难以监测并且生活“常态”是主要患者驱动因素的儿童和年轻成人群组中特别有价值)，或延长最小监测和胰岛素使用的“蜜月期”—经常在T1D诊断后的前六个月出现。虽然已知基于DNA的疫苗是安全的，但是已经在临床研究中测试的(刺激性或致耐受性)DNA疫苗均不具有足够的效力作为治疗例如T1D的独立方法。本领域已知的致耐受性DNA疫苗显示出很低的效能，并且通常需要高度人工系统来诱导所需的效果。因此，本领域需要具有显著增加的效力而不损害安全性概况且最好也不需要不方便的施用方案的致耐受性DNA免疫治疗疫苗。
技术实现思路
本专利技术涉及多顺反子载体/质粒，其共表达/编码细胞保留的抗原，如胰岛素，以及分泌的免疫调节物，如TGF-β、IL-10和可选的IL-2。本专利技术还涉及包含这类质粒的DNA免疫治疗疫苗以及这类药物制剂及其试剂盒。本专利技术最后涉及这类产品的医药用途以及制备这类质粒的方法。本文的质粒/DNA免疫治疗疫苗在治疗主要由T细胞驱动的自身免疫性疾病，例如1型糖尿病(T1D)中具有治疗潜力。在一方面，本专利技术提供了质粒，其编码：i.胰岛素抗原；ii.TGF-β；以及iii.IL-10。附图简述图1.环状质粒图谱。图2.图1质粒的载体产物的mRNA和翻译的蛋白质图谱。图3.经由G30针的三次注射传代的质粒剪切稳定性。图4.通过在30℃下生长(传代1-50，使用17小时孵育；传代51-100，使用22小时孵育)对质粒保留表型的证实。专利技术详述本专利技术的专利技术人在此提供了单一载体，其驱动多种分泌细胞因子以及细胞保留的抗原从单一启动子/多顺反子mRNA的表达。相比于用各自驱动单个组分表达的单独载体/质粒的混合物进行的免疫治疗疫苗接种，用在单个细胞中编码所有治疗组分的单一载体进行的DNA免疫治疗疫苗接种是高度优选的，因为用不同载体随机转染细胞不能保证从给定的特定转染细胞中表达所有组分，乃至任何特定比率的组分。单个多顺反子质粒/载体的转染导致在转染的细胞周围存在特定工程化的局部环境/微环境。以这种方式，可以将免疫调节物的组合添加至抗原，使得它们增强单个T细胞的所需免疫效果，而不需要高的系统性免疫调节物剂量，这种高剂量可能引起不良事件和广泛的免疫抑制。用DNA免疫治疗疫苗转染的宿主细胞产生免疫调节物方面的这种局部限制允许安全使用高效的细胞因子激素，这些细胞因子激素对T细胞应答的改变具有协同作用，但不能足够频繁地给药来达到效果，并且/或者被滴定以产生所需的应答，而没有不可接受的不良事件。例如，已知白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β1(TGF-β1)均能够从幼稚CD4+T细胞诱导调节性T细胞(Treg)。然而，与单独使用这两种细胞因子中的任一种相比，IL-10/TGF-β1组合在诱导Treg方面提供协同效应(有效性为15至20倍)(US6083919A)，并且与单独的任一细胞因子相比，该组合进一步在更广泛的靶细胞群体中导致免疫耐受性(ZellerJC,Panoskaltsis-MortariA,MurphyWJ等人,1999JImmunol.163(7):3684-91)。此外，已知白细胞介素-2(IL-2)可以扩充并稳定Treg，但另一方面也可能导致炎性应答。然而，IL-2和IL-10的组合导致抑制性Treg而不是炎性刺激。当循环T细胞遇到用本文DNA免疫治疗疫苗转染的细胞时，它们短暂暴露于次最佳浓度的IL-10和IL-2。循环T细胞略微偏向于耐受，并且如果它们也对共表达的抗原(例如胰岛素)具有反应性，则它们将与转染的细胞结合，从而接受更长时间的免疫调节物暴露，此外它们也会收到针对抑制效果对其进行编程/再训练(re-educate)的另一信号。以这种方式，当那些对编码的抗原具有响应性的T细胞遇到转染的细胞时，它们被选择性地再训练成抑制性表型。因此，本文的质粒/载体/DNA免疫治疗疫苗被设计用于在抑制疾病的自身免疫部位(例如，在T1D中为胰腺)诱导抗原特异性Treg积累，而不是通过表达的细胞因子激素直接影响疾病。除了抗原(在T1D的例子中为胰岛素)之外，本文的载体/操纵子/质粒还编码至少两种细胞因子(例如TGF-β1和IL-10)，这两种细胞因子一起协同抑制抗原呈递细胞以及T细胞功能，并驱动Treg的诱导。如果这也与有效暴露于抗原组合发生，则这种效果得到增强。在一个实施方案中，TGF-β1是对于其功能而言不需要加工或炎性环境的组成型活性形式。虽然Treg可以经由暴露于抗原和TGF-β1从幼稚T细胞产生，但是，Treg是“塑性的”，这意味着它们可以去分化并转化为Th17效应细胞，然后引起更多而不是更少的自身免疫破坏。IL-10与TGF-β1的组合除了是更有效的免疫调节物外，还抑制将会产生致病性Th17细胞而不是Treg的环境。在一个实施方案中，除抗原、TGF-β1、IL-10外，本文的多顺反子载体还编码IL-2。IL-2扩大Treg数目并稳定其表型(防止Treg细胞去分化为效应T细胞)，从而增加它们在发炎靶组织中的功能寿命。因此本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.质粒，其编码：i.胰岛素抗原；ii.TGF‑β；以及iii.IL‑10。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.02 EP 17150037.4;2017.05.02 EP 17169019.1;1.质粒，其编码：i.胰岛素抗原；ii.TGF-β；以及iii.IL-10。2.根据权利要求1所述的质粒，其中所述胰岛素抗原选自：胰岛素原、前胰岛素原及其功能性或免疫显性肽片段。3.根据前述权利要求中任一项所述的质粒，其中所述胰岛素抗原为内体靶向的胰岛素。4.根据前述权利要求中任一项所述的质粒，其中所述质粒以比IL-10低至少1/2的量表达胰岛素抗原和TGF-β。5.根据前述权利要求中任一项所述的质粒，其中所述质粒进一步共表达白细胞介素-2(IL-2)。6.根据前述权利要求中任一项所述的质粒，其中所述质粒包含：(i)分隔胰岛素抗原编码序列和TGF-β编码序列的FMDV2A元件，(ii)分隔TGF-β编码序列和IL-10编码序列的EMCVIRES元件，以及(iii)分隔IL-10编码序列和IL-2编码序列的2A元件。7.根据前述权利要求中任一项所述的质粒，其中所述TGF-β编码序列编码组成型活性TGF-β。8.根据前述权利要求中任一项所述的质粒，其中所述质粒包含：(i)内体靶向的...

【专利技术属性】
技术研发人员：J查普林，M维雅兰纳库拉，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK