新型鱼致病病毒制造技术

本发明专利技术涉及一种暂时称为尖吻鲈疱疹病毒(LCHV)的引起鱼中的疾病的新型鱼致病病毒，包含所述病毒的细胞培养物、所述病毒的DNA片段和相应的蛋白质，基于所述病毒、DNA和/或蛋白质的疫苗以及与所述病毒反应的抗体和用于检测所述病毒的诊断检测试剂盒。

New Fish Pathogenic Virus

The present invention relates to a novel fish pathogenic virus, temporarily referred to as LCHV, which causes diseases in fish, including cell cultures of the virus, DNA fragments and corresponding proteins of the virus, vaccines based on the virus, DNA and/or protein, antibodies reacting with the virus and diagnostic detection kits for detecting the virus.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型鱼致病病毒专利
本专利技术涉及一种引起鱼的疾病的新型鱼致病病毒，包含所述病毒的细胞培养物、所述病毒的DNA片段和相应的蛋白质，基于所述病毒、DNA和/或蛋白质的疫苗以及与所述病毒反应的抗体和检测所述病毒的诊断检测试剂盒。一般背景在最近的数十年中，观察到世界范围内鱼类消费的迅猛增加。这对于冷水鱼(诸如鲑鱼、大菱鲆、大比目鱼和鳕鱼)，以及热带鱼(诸如亚洲海鲈(澳洲肺鱼)、罗非鱼、遮目鱼、黄尾鱼、琥珀鱼、石斑鱼和军曹鱼)的消费，是均等的。因此，观察到养鱼场的数目和大小的增加，以便满足日益增长的市场需求。如从例如畜牧业已知的，密集地生活在一起的大量动物易发所有类型的疾病，甚至是在大规模商业畜牧时代之前几乎不曾知道或见到或甚至未知的疾病。鱼类养殖的情况同样如此。在2015年，在养鱼场(尤其是在越南和新加坡)中报道了亚洲海鲈(尖吻鲈(Latescalcarifer))中一种新疾病的爆发。观察到鱼经历脱鳞病-样症状。脱鳞病(ScaleDropDisease)是由最近分离并在WO2014/191445中描述的虹彩病毒科的病毒引起的。然而，使用脱鳞病病毒DNA特异性PCR引物测试，这些病例为脱鳞病阴性。当在田间(例如在养鱼场，因此不是在受控的实验室环境中)发现时，通常与这种新疾病相关的主要临床体征(不一定在每一条患病的鱼中看到所有这些这些症状)可被描述为如下。存在急性发作的临床体征与高百分比的发病率，其中许多鱼患病，并且在临床体征发作4-7天内死亡率高达60％(通常为30-70％)。这些临床体征可描述如下：患病的鱼具有全身性皮肤病变，变得嗜睡，并表现出明显的食欲不振。随着疾病的进展，皮肤病变变得更加严重，导致皮肤变黑及鳍和尾巴的淡白色斑块和糜烂，使鱼呈现幽灵般的外观。眼睛变得肿胀且稍微浑浊。经常发现的疾病的内部体征是脾脏和肾脏肿大。肾脏变得易碎并且易于剥离。可以经常观察到一些苍白的肝脏。随着疾病的进展，鳃变得苍白。专利技术目的本专利技术的目的是提供这种疾病的病原体。这使得能够提供旨在对抗所述疾病的检测方法和疫苗。专利技术概述已经发现，如上文所述的疾病的病原体是疱疹病毒和异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)的成员。它是属于双链DNA病毒的二十面体病毒。该病毒与异疱疹病毒科的病毒具有一定但低水平的相似性，所述异疱疹病毒科是对鱼类或两栖动物具有致病性的一个疱疹病毒科。异疱疹病毒科的病毒具有包膜，且具有二十面体和球形到多形的几何形状。它们的直径约为150-200nm。基因组是线性且非分段的，长度为约100-250kbp。本专利技术的病毒具有约130kbp的基因组。图1显示系统树，其指示已知的异疱疹病毒和新发现的病毒之间的关系。所述新病毒在该树中被称为尖吻鲈疱疹病毒(LatesCalcariferHerpesVirus，LCHV)。该树是使用MEGA程序第5版和使用标准设置制作的。(MEGA5：MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysisUsingMaximumLikelihood，EvolutionaryDistance，andMaximumParsimonyMethods.KoichiroTamura，DanielPeterson，NicholasPeterson，GlenStecher，MasatoshiNeiandSudhirKumar.Mol.Biol.Evol.28(10)：2731-2739.2011doi.10.1093/molbev/msr121AdvanceAccess公开2011年5月4日)。在Hanson，L等人的综述论文(Viruses3：2160-2191，2011)中概述了异疱疹病毒科，更具体而言在鱼中发现的异疱疹病毒科。根据本专利技术的疱疹病毒在亚洲海鲈(尖吻鲈)中发现。到目前为止，尚未描述对亚洲海鲈具有致病性的疱疹病毒。不能排除该病毒对其他(亚)热带鱼类也具有致病性。在已知的异疱疹病毒科中，鮰鱼疱疹病毒1(Ictaluridherpesvirus1，IHV1)是最接近的已知科成员。这种病毒对斑点叉尾鮰(channelcatfish)是致病的。然而，根据本专利技术的病毒与鮰鱼疱疹病毒1之间在核苷酸水平上的总体序列同一性远低于60％。与更远距离相关的鳗鱼疱疹病毒(AnguilidHerpesvirus，AHV)和锦鲤疱疹病毒(KoiHerpesvirus，KHV)的序列同一性更低。表1显示了在新的疱疹病毒中鉴定的几种基因与IHV1中的同源基因之间的比较。该表显示了鉴定的最重要的ORF(左栏)，条件是具有少于300个碱基对的鉴定的ORF在序列编号中没有被采用(为了该表的目的而是被简单忽略)，在表中已经显示了DNA(对于病毒的一个代表性实例，保藏在巴斯德研究所，见下文)上的位置、IHV1中的相应ORF以及与这些已知ORF的序列在氨基酸水平上的同一性水平。所述病毒的代表性实例已经保藏在国家微生物菌种保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganisms(CNCM)，巴斯德研究所，25RueduDocteurRoux，F-75724ParisCedex15，法国)，保藏号为CNCMI-5118(尖吻鲈疱疹病毒)。表1：新型疱疹病毒与IHV1之间的比较表1的说明ORF：LCHV中的开放阅读框(编号)框：基因组上的阅读框(1、2、3、负数指相反链)长度：以碱基对计的LCHVORF的长度AA长度：BLAST搜索中氨基酸命中的长度IHVId.：LCHVORF与相应的IHVORF之间的百分比氨基酸同一性IHV-1：鮰鱼疱疹病毒-1同源物：基于与已知蛋白质的同源性，由LHCVORF编码的蛋白质的推定功能。定义当前病毒的野生型形式是具有复制能力形式的病毒，如可以从患病鱼、特别是亚洲海鲈中分离，并且能够在分离出其野生型形式的病毒的鱼的品种的健康鱼中诱导相同的疾病。根据定义，灭活或减毒后的野生型病毒能够以其野生型形式诱导疾病。分离的病毒是这样的病毒，所述病毒从在自然界的患病宿主中通常与该病毒相关的组织中释放，并且在没有其他病毒和细菌的情况下转移到容器，诸如皿、烧瓶或生物反应器中。分离的病毒的实例是存在于生物反应器中特定细胞系的细胞培养物中的病毒。分离的DNA片段是从如存在于相应的、天然存在的能够复制的生物中的其天然(完整)DNA中取出的DNA片段。此类DNA片段可以如此存在于稳定液中，或者可以重组转移到另一种生物的DNA中。在每种情况下，DNA片段在本专利技术的意义上仍然是分离的。分离的蛋白质是从其天然环境取出的蛋白质，即脱离其与相应的天然存在的能够复制的生物的天然结合。疫苗是药物组合物，其对主体动物施用是安全的，并且能够在该动物中诱导针对致病微生物的保护性免疫，即诱导成功的预防性治疗。在这种意义上，成功的预防性治疗是这样的治疗，其帮助预防或减轻该病原体的感染或由该感染引起、由致病病原体的治疗后攻击导致的病症，特别是在减少在此类攻击后其在宿主中的负荷，并任选地帮助预防或减轻由病原体的治疗后感染引起的一种或多种临床表现。开放阅读框(ORF)是具有编码蛋白质或肽的潜力的阅读框的一部分。ORF是连续的一段密码子，其不含终止密码子。实施方案在第一个实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的疱疹病毒，其是异疱疹病毒科的成员，并且以其野生型形式引起亚洲海鲈中的疾病，所述疾病的特征在于以下体征：攻击后3天左右临床体征发作，导致皮肤变黑并伴有苍白色斑块和鳍糜烂的全身皮肤病变，嗜睡伴有观察到的失去游泳平衡，食欲不振，鳃盖呼吸率增加，和攻击后约2周发生死亡。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.11 EP 16183694.51.分离的疱疹病毒，其是异疱疹病毒科的成员，并且以其野生型形式引起亚洲海鲈中的疾病，所述疾病的特征在于以下体征：攻击后3天左右临床体征发作，导致皮肤变黑并伴有苍白色斑块和鳍糜烂的全身皮肤病变，嗜睡伴有观察到的失去游泳平衡，食欲不振，鳃盖呼吸率增加，和攻击后约2周发生死亡。2.根据权利要求1的分离的疱疹病毒，其特征在于，所述病毒具有DNA，其在其全长上与具有根据SEQIDNO：1的序列的DNA具有至少70％的同一性。3.根据权利要求2的分离的疱疹病毒，其特征在于，在所述病毒的DNA中，至少95％的开放阅读框与具有SEQIDNO：1的序列的DNA的相应开放阅读框具有至少80％的序列同一性。4.分离的疱疹病毒，其是异疱疹病毒科的成员，所述病毒具有以保藏号CNCMI-5118保藏在法国巴黎巴斯德研究所，国家微生物菌种保藏中心(CNCM)的病毒的至少一种鉴定特征。5.根据权利要求4的分离的疱疹病毒，其特征在于，所述鉴定特征选自：-所述病毒具有DNA序列，其在其全长上与根据SEQIDNO：1的序列具有至少70％的同一性；-所述病毒以其野生型形式引起亚洲海鲈中的疾病，所述疾病特征是以下体征：攻击后3天左右临床体征发作，导致皮肤变黑并伴有苍白色斑块和鳍糜烂的全身皮肤病变，嗜睡伴有观察到的失去游泳平衡，食欲不振，鳃盖呼吸率增加，和攻击后约2周发生死亡；-所述病毒包含主要包膜蛋白(MEP)基因，其与如SEQIDNO：2中所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性水平；-所述病毒包含dUTP酶基因，其与如SEQIDNO：4中所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性水平；-所述病毒包含终止酶基因，其与如SEQIDNO：6中所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性水平；-所述病毒包含聚合酶基因，其与如SEQIDNO：8中所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性水平。6.分离的疱疹病毒，其是异疱疹病毒科的成员并且以其野生型形式引起亚洲海鲈中的疾病，其特征在于，所述病毒具有DNA，其在其全长上与具有根据SEQIDNO：1的序列的DNA具有至少70％的同一性。7.分离的疱疹病毒，其是异疱疹病毒科的成员并且以其野生型形式引起亚洲海鲈中的疾病，其特征在于，所述病毒具有DNA，其中至少95％的开放阅读框与具有根据SEQIDNO：1的序列的DNA的相应开放阅读框具有至少80％的序列同一性。8.分离的疱疹病毒，其包含主要包膜蛋白(MEP)基因，其特征在于：a)所述病毒是异疱疹病毒科的成员；b)所述病毒引起亚洲海鲈中的疾病；c)所述MEP基因的核苷酸序列与如SEQIDNO：2中所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性水平。9.分离的疱疹病毒，其包含dUTP酶基因，其特征在于：a)所述病毒是异疱疹病毒科的成员；b)所述病毒引起亚洲海鲈中的疾病；c)所述dUTP酶基因的核苷酸序列与如SEQIDNO：4中所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性水平。10.根据权利要求8或9的分离的疱疹病毒，其中所述病毒包含主要包膜蛋白基因和dUTP酶基因，其特征在于，所述MEP基因的核苷酸序列与如SEQIDNO：2中所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性水平，并且所述dUTP酶基...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·F·张，K·S·吴，L·格里塞，A·德格罗弗，W·沃格尔，L·万德赫克，M·戴斯，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL