一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物纳米医药技术领域，具体涉及一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法及其应用，该方法步骤为：充分混合肿瘤细胞裂解液(lysis)、多肽水凝胶水溶液和CpG‑ODN水溶液，向混合液中滴加氯化钠水溶液，直到混合液中氯化钠的浓度为0.9wt％；静置混合液获得稳定装载肿瘤杀伤性多肽/CpG/lysis的杂交纳米肿瘤疫苗。本发明专利技术的方法利用多肽水凝胶纳米载体作为桥梁，装载肿瘤细胞抗原和免疫激活剂，制备的肿瘤疫苗具有合适的粒径，可增加肿瘤细胞疫苗的细胞摄取和胞浆定位，更大程度的激活机体的固有免疫和适应性免疫，增加抗肿瘤免疫效应，解决普通肿瘤抗原疫苗易降解，免疫原性低，免疫反应激活效率低下等问题。本发明专利技术的杂交凝胶疫苗可应用于制备肿瘤疫苗药物。

Preparation and Application of Hybrid Nano-tumor Vaccine

The invention relates to the field of biological nanomedicine technology, in particular to the preparation method and application of a hybrid nano-cancer vaccine. The steps of the method are: fully mixing lysis of tumor cells, polypeptide hydrogel aqueous solution and CPG_ODN aqueous solution, dropping sodium chloride aqueous solution into the mixed solution until the concentration of sodium chloride in the mixed solution is 0.9wt%; Hybrid nano-cancer vaccine loaded with tumor killer polypeptide/CpG/lysis was established. The method of the invention utilizes polypeptide hydrogel nanocarrier as a bridge, loads tumor cell antigen and immune activator, and the prepared tumor vaccine has an appropriate particle size, can increase the cell uptake and cytoplasmic localization of the tumor cell vaccine, activate the inherent and adaptive immunity of the body to a greater extent, increase the anti-tumor immune effect, and solve the problem that the ordinary tumor antigen vaccine is easy to degrade. Low immunogenicity and low activation efficiency of immune response. The hybrid gel vaccine of the invention can be applied to prepare tumor vaccine drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物纳米医药
，具体涉及一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法及其应用。
技术介绍
肿瘤免疫治疗是应用免疫学方法，激发与诱导体内的免疫应答反应，产生杀伤肿瘤细胞的特异性因子杀伤肿瘤细胞、从而抑制肿瘤生长的治疗方式。因为恶性黑色素瘤免疫原性强、对免疫治疗敏感，在所有的恶性肿瘤治疗中，免疫治疗在转移型黑色素瘤中应用最为广泛。在免疫治疗中，肿瘤细胞疫苗是近年来研究的热点之一。肿瘤细胞疫苗是通过物理、化学或者生物学的方法(加热、辐射等)处理肿瘤细胞制备得到的，此种疫苗保留了原有的免疫原性而且没有致瘤作用，其主要通过启动以肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞反应为主的抗肿瘤效应。全肿瘤细胞疫苗不仅可以提供肿瘤全部抗原，诱导机体产生针对肿瘤抗原的免疫应答，而且不引发机体的排斥反应，是一种理想的疫苗方案。但肿瘤抗原疫苗易降解、难以有效递送至淋巴结中，且免疫原性低，即使递送到免疫细胞中，也会很快降解，免疫反应激活效率低下。因此，急需建立有效方法和手段克服肿瘤细胞疫苗的上述缺陷。CpG基序是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸序列(CpG-ODN)。这种序列可激活多种免疫效应细胞，促进树突状细胞、巨噬细胞等专职抗原提呈细胞以及B细胞的成熟和活化，刺激细胞因子的分泌，为T细胞、NK细胞的活化提供共刺激信号。在动物模型中，CpG-ODN可以增强各种类型的抗原(例如：全细胞疫苗)特异的体液和细胞免疫应答，是一种高效低毒的免疫佐剂。但是，未经修饰的CpG-ODN通常易被核酸酶降解，细胞摄取率低。纳米技术的发展为解决核酸药物的递送问题提供了新的工具，已有大量研究报道显示，纳米材料负载的CpG核酸药物表现出高活性、低毒性、生物相容性好等特点，有望作为新型免疫治疗制剂应用于疾病的治疗之中。多肽水凝胶是以多肽分子为凝胶因子，通过自组装作用束缚住水分子形成的半固体透明状凝胶，其生物相容性好，无毒副作用，近年来被广泛作为新型药物载体来研究。多肽水凝胶作为药物载体，能够装载各种药物及疫苗，且药物包封率可达百分之百。同时，凝胶体系由于其良好的结构可控性，是一类重要的药物缓控释载体，其释药缓慢，药物浓度平稳，在延长药物作用时间，减少副作用方面有明显的优势。但目前的多肽水凝胶均无免疫激活功效。因此，开发一种既能够增加细胞对其摄取、实现胞浆定位，又能高效率的激活机体的固有免疫及适应性免疫反应的疫苗，成为亟待解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术中的技术空白，本专利技术的目的是提供一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法及其应用，该方法可增加肿瘤细胞疫苗的细胞摄取和胞浆定位，更大程度的激活机体的固有免疫和适应性免疫，增加抗肿瘤免疫效应，解决普通肿瘤抗原疫苗易降解，免疫原性低，免疫反应激活效率低下等问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一个目的在于提出一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法，步骤为：充分混合肿瘤细胞裂解液、多肽水凝胶水溶液和CpG-ODN水溶液，向混合液中滴加氯化钠水溶液，直到混合液中氯化钠的浓度为0.9wt％；静置混合液获得稳定装载肿瘤杀伤性多肽/CpG/lysis的杂交纳米肿瘤疫苗。进一步地，所述肿瘤细胞裂解液的制备方法为：肿瘤细胞经预冷的PBS重悬后进行5个冰融循环，冰融循环后获得的裂解液经离心分离后弃掉离心管底部的细胞碎片，得到的上层细胞液冷冻干燥为粉末储存备用；待配置时，将粉末溶解于水中最终得到肿瘤细胞裂解液；1个冰融循环为：置液氮内冷冻5min后置于37°水浴锅中融化5min。进一步地，所述多肽水凝胶包括C端的自组装结构域RAD32和N端的杀伤结构域蜂毒肽，所述自组装结构域和所述杀伤结构域通过柔性结构域GG连接形成Melittin-RADA32。更进一步地，所述杂交纳米肿瘤疫苗中，肿瘤细胞裂解物的终浓度为10μg/ml，Melittin-RADA32的终浓度为5-20mg/ml，CpG-ODN的终浓度为1-2mg/ml。进一步地，配制肿瘤细胞裂解液、多肽水凝胶水溶液和CpG-ODN水溶液时，采用的溶剂均为去离子水。进一步地，所述稳定装载肿瘤杀伤性多肽/CpG/lysis的杂交纳米肿瘤疫苗是通过静置时氨基酸分子间的氢键作用自组装形成的，反应条件为在4℃下静置2-12小时。进一步地，所述氯化钠水溶液的初始质量浓度为10％。本专利技术的第二个目的在于提出上述任一项所述的制备方法获得的杂交纳米肿瘤疫苗。本专利技术的第三个目的在于提出上述的杂交纳米肿瘤疫苗在制备肿瘤疫苗药物中的用途。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果如下：(1)本专利技术提供的一种用于肿瘤免疫治疗的纳米肿瘤疫苗的制备方法，利用多肽水凝胶纳米载体作为桥梁，装载肿瘤细胞抗原和免疫激活剂，提供了更高的免疫激活效率，且包封率可达百分之百。(2)本专利技术选用的多肽水凝胶载体具有缓释作用，可以延长作用时间，持续激活机体的免疫反应。(3)通过本专利技术的方法制备的肿瘤疫苗具有合适的粒径(20-50nm)，能够高效地聚集到淋巴结并停留，增加肿瘤抗原被专职APC摄取并递呈的效率。克服了因粒径太大导致的纳米粒生理性停留在注射部位、与细胞外基质相互作用、抗原难以释放的问题，也克服了因粒径太小导致的进出淋巴结速率过快、减少APC对肿瘤抗原的识别、不利于递呈等问题。(4)本专利技术选用的多肽水凝胶纳米载体，在体内经过生物化学反应后，反应降解产物为氨基酸，不产生免疫反应和炎症反应，毒副作用低。(5)实验证明，本专利技术制备的杂交纳米肿瘤疫苗无论是在黑色素瘤小鼠预防模型还是治疗模型中，均表现出很好的抗肿瘤作用。(6)本专利技术提供的杂交纳米肿瘤疫苗制备方法工艺简单，便于规模化生产。附图说明图1为实施例1中MCL成像示意图。图2为实施例1中MCL透射电镜图。图3为实施例2中对MCL安全性评价时，不同处理方式的小鼠血液中的AST、ALT、BUN、Cr、UA指标的变化情况。图4为实施例3中MCL对DC细胞的激活能力评估结果。图5为实施例4中MCL预防治疗抗肿瘤能力评估结果。图6为实施例5中MCL原位皮下治疗抗肿瘤能力评估结果，其中图6A为MCL原位皮下治疗的抗肿瘤作用，小鼠的瘤体变化结果；其中6B为MCL原位皮下治疗的抗肿瘤作用，小鼠的生存期变化情况；C和D为原位皮下治疗的抗肿瘤作用，小鼠的肿瘤生长曲线。具体实施方式下面申请人结合具体实施例对本专利技术技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为本专利技术请求保护范围的限定。本专利技术实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道获得。实施例1：杂交纳米肿瘤疫苗的制备具体制备方法如下：(1)取20mg无菌Melittin-RADA32粉末溶解于1ml无菌去离子水中，获得浓度为20mg/ml的Melittin-RADA32溶液备用。(2)配置8mg/ml的CpG-ODN和40μg/ml的lysis水溶液等比混合。(3)将步骤(1)中的Melittin-RADA32溶液与步骤(2)中的溶液充分混合，并在混合液中加入氯化钠水溶液(终浓度为0.9wt％)，获得Melittin-RADA32/CpG/lysis纳米疫苗，其中Melittin-RADA32、CpG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，步骤为：充分混合肿瘤细胞裂解液、多肽水凝胶水溶液和CpG‑ODN水溶液，向混合液中滴加氯化钠水溶液，直到混合液中氯化钠的浓度为0.9wt％；静置混合液获得稳定装载肿瘤杀伤性多肽/CpG/lysis的杂交纳米肿瘤疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，步骤为：充分混合肿瘤细胞裂解液、多肽水凝胶水溶液和CpG-ODN水溶液，向混合液中滴加氯化钠水溶液，直到混合液中氯化钠的浓度为0.9wt％；静置混合液获得稳定装载肿瘤杀伤性多肽/CpG/lysis的杂交纳米肿瘤疫苗。2.根据权利要求1所述的一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞裂解液的制备方法为：肿瘤细胞经预冷的PBS重悬后进行5个冰融循环，冰融循环后获得的裂解液经离心分离后弃掉离心管底部的细胞碎片，得到的上层细胞液冷冻干燥为粉末储存备用；待配置时，将粉末溶解于水中最终得到肿瘤细胞裂解液；1个冰融循环为：置液氮内冷冻5min后置于37°水浴锅中融化5min。3.根据权利要求1所述的一种杂交纳米肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述多肽水凝胶包括C端的自组装结构域RAD32和N端的杀伤结构域蜂毒肽，所述自组装结构域和所述杀伤结构域通过柔性结构域GG连接形成Melittin-RAD...

【专利技术属性】
技术研发人员：金红林，黄浩，周洁，黄壁旺，洪磊，聂晓芬，廖婷，潘雄华，
申请(专利权)人：斯潘思生命科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42