基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途技术

基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途，属于生物技术领域。其特征在于：菌株保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana。上述基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途，所获改良菌株的主要特征如下，基因的转录表达水平较野生菌株提高308倍，在正常培养条件下产生的分生孢子在UVB紫外辐射下失活50%和90%的辐射剂量较野生菌株分别提高34%和43%，在UVB致死剂量辐射下完全失活的分生孢子在可见光照射下被修复即恢复萌发的能力大幅增强；可显著增强真菌杀虫剂抗紫外辐射的能力。

【技术实现步骤摘要】
基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途
本专利技术属于生物
，具体为基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途。
技术介绍
真菌杀虫剂是替代化学杀虫剂的侵染性活体细胞制剂，具有杀虫谱宽、田间持效期长、不产生抗药性和环境友好等一系列优点。但是，分生孢子等剂型化的真菌细胞在田间应用时常遭受阳光紫外辐射的损伤而影响田间害虫防治效果的稳定性和持效性，突出表现在害虫易发且阳光辐射强烈的夏季，由此限制了真菌杀虫剂的应用季节和范围。阳光紫外辐射中包含UVC(<290nm)、UVB(290-320nm)和UVA(320-400nm)三种有害射线成分，共中最有害的UVC在阳光抵达地球表面之前即被大气臭氧层全部过滤去除，能够到达地球表面的有害射线主要是UVB，其次是UVA。因此，阳光UVB紫外辐射对剂型化真菌细胞的损伤最大，较大波长UVA的影响则相当有限。真核细胞抵抗紫外辐射损伤的机制主要靠隐花色素/光裂合酶家族（英文缩写为CPF）成员的作用。CPF家族在丝状真菌中也广泛存在，成员数量及其功能因菌种而异。丝状真菌的相关研究报道常用UVC辐射的方式分析CPF成员缺失细胞对紫外辐射的敏感性及其受损伤DNA的修复能力变化，证明有的CPF成员可修复UVC辐射诱导产生和积累的环丁烷嘧啶二聚体DNA损伤，有的CPF成员则可修复同样诱导产生和积累的6-4嘧啶-嘧啶DNA损伤，但并非真菌所有CPF成员都具有如此的DNA损伤修复功能。值得注意的是，这些报道一般用地球表面并不存在的UVC辐射模拟研究CPF成员对紫外辐射损伤的抵抗力及其修复功能，罕见针对地球表面阳光中的主要有害射线UVB。白僵菌（Beauveria）、绿僵菌（Metharhizium）等昆虫病原真菌的分生孢子制剂广泛用于农林害虫生物防治，采用生物技术方法提高这些真菌制剂抗紫外辐射的能力在害虫生物防治实践中具有重要意义和应用价值，但迄今未见成功利用内源CPF成员编码基因（简称CPF基因）提高生产菌株抗UVB紫外辐射的报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于设计提供一种基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途的技术方案，其利用球孢白僵菌（Beauveriabassiana）基因组中CPF基因之一BbCPF2构建在该菌野生菌株中超表达的菌株，有效提高分生孢子对UVB紫外辐射的耐受力及受损失活孢子的自然可见光修复能力。所述的基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于：菌株保藏名称为：球孢白僵菌Beauveriabassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年9月10日，保藏编号：CGMCCNo.16363。所述的基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于包括以下步骤：1）从球孢白僵菌野生菌株基因组DNA中克隆转录延伸因子基因tef的强启动子Ptef,经限制性内切酶XmaI消化后插入p0380-bar质粒的相应酶切位点，构成内源靶标基因超表达的基础质粒p0380-Ptef-bar，其中bar为抗草丁膦的筛选标记基因；2）从球孢白僵菌野生菌株基因组cDNA中克隆光修复基因BbCPF2的编码序列（基因组标记位点：BBA_01034），插入经限制内切酶XmaI和BamHI消化后p0380-Ptef-bar质粒的相应酶切位点之间，构建成BbCPF基因的超表达质粒p0380-Ptef-BbCPF-bar；3）将2）中所构建超表达质粒在大肠杆菌EscherichiacoliDH5a中扩增后，用农杆菌介导的真菌转化法转入球孢白僵菌野生菌株中；4）经草丁膦抗性筛选的疑似转化菌株在正常条件下培养3天，提取RNA反转录成cDNA，用实时定量PCR（qPCR）方法测定BbCPF2基因在各cDNA样品中相对于野生菌株的转录水平，转录表达水平最高的转化子即为球孢白僵菌抗紫外辐射菌株。所述基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株的构建方法，其特征在于：将步骤2）构建的超表达载体转入害虫生防真菌的方法为：农杆菌介导法转化方法、原生质体转化方法、芽生孢子转化方法或电击转化方法。所述基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于用于提高真菌杀虫剂对阳光紫外辐射的抵抗力与田间害虫防治的稳定性及持效性。上述基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途，本专利技术利用球孢白僵菌内源强启动子Ptef驱动BbCPF2基因在球孢白僵菌野生株中高表达，使BbCPF2在筛选获得的工程菌株中的转录表达水平较野生菌株提高308倍，工程菌株所产分生孢子抗UVB紫外辐射的能力提高34%以上，其在UVB致死或过致死剂量辐射下完全失活的分生孢子在可见光下暴露1～3小时的修复率即恢复萌发率达19～59%。本专利技术基于内源光修复基因BbCPF2超表达的工程菌株，可用于抗紫外辐射真菌杀虫剂的研发，因而对具有重要的应用价值和前景。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：高表达BbCPF2基因的球孢白僵菌工程菌株构建步骤1：目标基因超表达基础质粒的构建。利用自行设计的如下配对引物，F:CCACCATGTTGGGCCCGGCGCGCCTACTGCCGCAAGCAATTCTTTAR:CAGGTCGACGGATCCCCGGGTTTGAAGGTGTTTGTGAT从球孢白僵菌野生菌株（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号：CGMCCNo.13566，以下简称野生菌株）基因组DNA中扩增内源强启动子Ptef的1369bp序列，经XmaI酶切后插入插入先期构建的基础质粒p0380-bar的XmaI位点，即成基因超表达基础质粒p0380-Ptef-bar。步骤2：光修复基因BbCPF2超表达质粒的构建。将野生菌株含107个分生孢子/mL的悬液100mL均匀涂抹在贴玻璃纸的萨氏培养基平板上，在25℃和光周期12:12的最适条件下培养4天，取培养物液氮研磨至粉末状。在RNAisoTMPlusReagent(TaKaRa,中国大连)作用下，自液氮研磨物中提取提取总RNA，继而用试剂盒PrimeScriptRTreagentkit(TaKaRa)将总RNA反转录为cDNA。利用自行设计的如下配对引物，从cDNAF:CAAACACCTTCAAACCCGGGATGACAAAGCCCAGAGTCATTTATTR:GGCTGCAGGTCGACGGATCCTCACGTTTTCTGCTTCTTCGCTGAC中扩增BbCPF2基因1872bp的编码序列（基因组标记位点：BBA_01034），经XmaI/BamHI酶切后插入p0380-Ptef-bar的相应酶切位点，即成BbCPF2超表达质粒p0380-Ptef-BbCPF2-bar。步骤3：高表达BbCPF2转基因菌株的构建与筛选。运用农杆菌介导法，将p0380-Ptef-BbCPF2-bar质粒转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 基于内源光修复基因

【技术特征摘要】
1.基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于：菌株保藏名称为：球孢白僵菌Beauveriabassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年9月10日，保藏编号：CGMCCNo.16363。2.如权利要求1所述的基于内源光修复基因BbCPF2超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于包括以下步骤：1）从球孢白僵菌野生菌株基因组DNA中克隆转录延伸因子基因tef的强启动子Ptef,经限制性内切酶XmaI消化后插入p0380-bar质粒的相应酶切位点，构成内源靶标基因超表达的基础质粒p0380-Ptef-bar，其中bar为抗草丁膦的筛选标记基因；2）从球孢白僵菌野生菌株基因组cDNA中克隆光修复基因BbCPF2的编码序列（基因组标记位点：BBA_01034），插入经限制内切酶XmaI和BamHI消化后p0380-Ptef-...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯明光，王定一，应盛华，童森淼，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33