针对MELK的单克隆抗体及其使用制造技术

本发明专利技术涉及相对于MELK的单克隆抗体。此外，本发明专利技术提供了：使用所述抗体来诊断MELK相关疾病的方法、检测出MELK蛋白质的方法、判定通过MELK抑制剂产生的治疗后的药效的方法、筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象的方法、以及包含所述抗体的诊断试剂。

Monoclonal antibodies against MELK and their use

The present invention relates to monoclonal antibodies relative to MELK. In addition, the present invention provides a method for diagnosing MELK-related diseases by using the antibodies, a method for detecting MELK proteins, a method for determining the therapeutic efficacy of MELK inhibitors after treatment, a method for screening subjects with higher therapeutic efficacy by using the MELK inhibitors, and a diagnostic reagent containing the antibodies.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对MELK的单克隆抗体及其使用
本专利技术涉及：针对MELK的单克隆抗体、使用上述抗体诊断MELK相关疾病的方法、检测出MELK蛋白质的方法、判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效的方法、筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象的方法、以及包含上述抗体的诊断试剂。
技术介绍
MELK，即母体胚胎亮氨酸拉链激酶(参考序列：Genbank登录号NM_014791.3；SEQIDNO:21)，以前已被认定是参与哺乳动物胚胎发育的snf1/AMPK丝氨酸·苏氨酸激酶家族的新成员(HeyerBSetal.,DevDyn.1999Aug，215(4):344-51(非专利文献1))。结果表明，该基因在干细胞的再生(NakanoIetal.,JCellBiol.2005Aug1，170(3):413-27)、细胞周期的进行(BlotJetal.,DevBiol.2002Jan15,241(2):327-38(非专利文献3)；SeongHAetal.,BiochemJ.2002Feb1,361(Pt3):597-604(非专利文献4))、以及mRNA前体的剪接(VulstekeVetal.,JBiolChem.2004Mar5,279(10):8642-7.Epub2003Dec29(非专利文献4))中发挥重要作用。此外，通过使用含有23040个基因的全基因组的cDNA微阵列进行的基因表达谱分析，显示MELK在乳腺癌中得到上调(LinMLetal.，BreastCancerRes.2007,9(1)：R17(非专利文献6)、WO2006/016525(专利文献1)、WO2008/023841(专利文献2))。实际上，MELK在例如：肺癌细胞、膀胱癌细胞、淋巴瘤细胞、宫颈癌细胞这样几种癌细胞中得到上调(参照WO2004/031413(专利文献3)、WO2007/013665(专利文献4)、WO2006/085684(专利文献5))。根据多种人体组织及癌细胞株的Northern印迹分析，证明了：MELK在大部分的乳腺癌或乳腺癌细胞株中以显著更高的水平过度表达，但在正常的重要器官(心脏、肝脏、肺和肾脏)中则不表达(WO2006/016525(专利文献1))。此外，证明了通过siRNA抑制MELK表达，可以显著抑制人乳腺癌细胞的增殖(专利文献1)，并且抗MELK小分子抑制剂缩小了小鼠的乳腺癌异种移植片(ChungSetal.，Oncotarget.2012Dec3(12):1629-1640(非专利文献7)、ChungSetal.，Oncotarget.2016Feb24，7(14):18171-18182(非专利文献)8))。因此，MELK被认为是抗癌剂的合适靶标，并且可以预测与其对应的单克隆抗体可以在治疗中用作诊断剂。除了针对乳腺癌、恶性淋巴瘤、结肠癌的曲妥珠单抗的诊断剂、利妥昔单抗的诊断剂、以及贝伐单抗的诊断剂这样的单克隆抗体的成功临床应用以外，其他几种针对其他分子靶点的单克隆抗体正在研发中，它们的诊断效果正在评价中。从治疗剂的有效的患者的选择这样的观点出发，期待带来更有效的治疗方法的治疗剂。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2006/016525专利文献2：WO2008/023841专利文献3：WO2004/031413专利文献4：WO2007/013665专利文献5：WO2006/085684非专利文献非专利文献1：HeyerBSetal.,DevDyn.1999Aug,215(4):344-51非专利文献2：NakanoIetal.,JCellBiol.2005Aug1,170(3):413-27非专利文献3：BlotJetal.,DevBiol.2002Jan15,241(2):327-38非专利文献4：SeongHAetal.,BiochemJ.2002Feb1,361(Pt3):597-604非专利文献5：VulstekeVetal.,JBiolChem.2004Mar5,279(10):8642-7.Epub2003Dec29非专利文献6：LinMLetal.,BreastCancerRes.2007,9(1):R17非专利文献7：ChungSetal.,Oncotarget.2012Dec,3(12):1629-1640非专利文献8：ChungSetal.,Oncotarget.2016Feb24,7(14):18171-18182
技术实现思路
专利技术所解决的技术问题就使用了分子靶向治疗剂的肿瘤治疗中的诊断剂而言，重要的是，检测出在靶肿瘤的大部分中过度表达并且在正常组织中不表达或以最低限度表达的细胞蛋白质。然而，难以以高灵敏度检测出在肿瘤中特异性表达的蛋白质，也难以获得针对这种蛋白质的抗体。例如，关于被认为是抗癌剂的靶标的MELK，市售有数种抗体。然而，当使用本专利技术人获得的市售的抗体来尝试对MELK表达细胞进行染色时，即使在MELK的表达水平低的细胞中也可以产生阳性信号(假阳性)。如上所述，通过免疫学特异性不充分的抗体，可能无法以抗体的反应强度作为指标而明确地检测出MELK的表达水平的差异。因此，本专利技术的目的是提供一种以高灵敏度与MELK特异性结合的抗体。解决问题的技术手段因此，本专利技术人在用MELK抗原对小鼠进行免疫而得的单克隆抗体中搜索特异性结合MELK的抗体时，能够特异性结合在细胞中强制表达的MELK蛋白质，并且成功确定了可以特异性且高灵敏度地检测出在细胞或组织中表达的内因性的MELK蛋白质的克隆。具体而言，本专利技术涉及：[1]一种抗体或其抗原结合片段，其能够与MELK蛋白或其部分肽结合，并且包含重链可变区及轻链可变区中的任意之一或二者，其中，所述重链可变区包含：CDR1，其包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；以及CDR3，其包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。所述轻链可变区包括：CDR1，其包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；以及CDR3，其包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。[2]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区及轻链可变区中的任意之一或二者，其中，所述重链可变区包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。[3]根据[1]或[2]所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性识别包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的多肽。[4]一种抗体或其抗原结合片段，其与[1]～[3]中任一项所述的抗体竞争与MELK的特异性结合。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其结合于亲和标记、酶标记、放射性同位素标记或荧光标记。[6]一种多核苷酸，其编码[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。[7]一种试剂，其包含[1]～[5]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，并且用于诊断MELK相关疾病、判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效、或筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象。[8]一种诊断受试对象中MELK相关疾病或所述疾病的发病原因的方法，其包括以下阶段：(a)使从所述受试对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体或其抗原结合片段，其能够与MELK蛋白或其部分肽结合，并且包含重链可变区及轻链可变区中的任意之一或二者，其中，所述重链可变区包含：CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。所述轻链可变区包括：CDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.31 JP 2016-1690851.一种抗体或其抗原结合片段，其能够与MELK蛋白或其部分肽结合，并且包含重链可变区及轻链可变区中的任意之一或二者，其中，所述重链可变区包含：CDR1，其包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；以及CDR3，其包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。所述轻链可变区包括：CDR1，其包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；以及CDR3，其包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区及轻链可变区中的任意之一或二者，其中，所述重链可变区包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性地对包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列的多肽进行识别。4.一种抗体或其抗原结合片段，其与权利要求1～3中任一项所述的抗体竞争与MELK的特异性结合。5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其结合于亲和标记、酶标记、放射性同位素标记或荧光标记。6.一种多核苷酸，其编码权利要求1～5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。7.一种试剂，其包含权利要求1～5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，并且用于诊断MELK相关疾病、判定通过MELK抑制剂进行治疗后的药效、或筛选通过MELK抑制剂产生的治疗效果较高的受试对象。8.一种诊断受试对象中MELK相关疾病或所述疾病的发病原因的方法，其包括以下阶段：(a)使从所述受试对象分离得到的样品与权利要求1～5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触的阶段；(b)通过检测出所述抗体或其抗原结合片段与所述样品的结合，来检测所述样品中的MELK蛋白质的阶段；以及(c)对所述样品中的MELK蛋白质水平与对照进行比较的阶段，当MELK蛋白质水平高于对照时，表示所述受试对象患有所述疾病或...

【专利技术属性】
技术研发人员：原田阳介，郑秀莲，中村祐辅，
申请(专利权)人：肿瘤疗法科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本,JP