鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒：提取样品中的DNA作为模板，利用设计的多对物种特异性引物，进行多重PCR扩增，对多重PCR扩增的产物进行高分辨熔解曲线分析，根据扩增产物熔解峰的位置判别样品中所含的动物源性成分。本发明专利技术操作简单、检测周期短、特异性强、检测结果可靠，可以避免开管造成污染问题以及实现大规模样品的检测。

Multifluorescent PCR and Kit for Identification of Animal-derived Components

The invention discloses a multiplex fluorescent PCR method and kit for identifying animal-derived components: DNA in the sample is extracted as a template, multiplex PCR amplification is carried out by using the designed multiple pairs of species-specific primers, and the products amplified by multiplex PCR are analyzed by high-resolution melting curve, and the animal-derived components in the sample are discriminated according to the location of the melting peak of the amplified products. The invention has the advantages of simple operation, short detection period, strong specificity and reliable detection results, and can avoid the pollution caused by the opening of pipes and realize the detection of large-scale samples.

【技术实现步骤摘要】
鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学鉴定领域，具体涉及一种利用多重PCR及高分辨熔解曲线分析鉴定生乳、乳制品等中的山羊、绵羊、牛、水牛等不同动物源性成分的方法及试剂盒。
技术介绍
随着生活水平的不断提高，对生乳及乳制品的需求逐渐由数量向质量转变，人们更加倾向于营养更丰富的乳制品，如营养价值更高的羊奶和水牛奶。然而，随着消费需求的不断增加，为避免企业使用相对廉价的原料冒充这些营养价值更高的乳制品进行销售，世界各国都建立了食品标签制度，要求食品必须要标明原料成分，以打击掺假造假情况。生乳及乳制品等产品中动物源性成分的检测是一种重要的识别掺假的手段，建立快速、准确的动物源性成分检测方法具有重要意义。随着分子生物学的发展，目前对于生乳及乳制品等产品的掺假检测主要基于蛋白质的检测和核酸的检测两个方面。目前运用的多重PCR方法在检测核酸时，一部分是基于探针技术开发的，检测成本高(FoodControl,2007,18:1149)；一部分是基于电泳的方法产生的，检测数量受限，操作繁琐费时，而且电泳是在PCR扩增完成后开管操作，导致气溶胶的污染，产生假阳性(JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2012,60:10480)。以DNA为基础的实时荧光PCR具有特异、灵敏、简便、快速和闭管操作等优点，在乳制品掺假检测方面得到了快速发展。其中，熔解曲线技术是采用染料实时监测PCR扩增，当染料与双链DNA结合时，发出荧光；随着温度的升高，DNA双链逐渐解开，染料从DNA链上释放出来时，信号急剧下降，把50％DNA分子发生变性的温度称为熔解温度(Tm)。如果不同的扩增产物长度不同、GC比值不同，进行熔解曲线分析时就会有其独特的熔解曲线，并且熔解曲线位置和Tm值都是不同的，目的是检测非特异性扩增。而高分辨熔解曲线(HighResolutionMelting,HRM)分析是在普通熔解曲线的基础上发展起来的，其利用DNA饱和荧光染料、高精度的检测仪器以及相关分析软件，能够监测到的熔解温度差异小于0.5℃，并且其对于PCR扩增产物的区分检测已精确至单个碱基差异水平，同时，高分辨熔解曲线技术采用的饱和染料，其发光效率不容易被抑制，能够以更高的浓度应用于PCR扩增体系中，由于在熔解过程中这些染料重新与核酸链的非熔解区域结合的游离染料相对更少，荧光信号保真度更高，因此能够提供更大的熔解敏感度和更高的熔解谱分辨率，生成更为清晰的熔解曲线(FoodChemistry,2014,158：245)。HRM分析由于具有操作简单、成本低廉、高通量、灵敏度强、特异性高和实现真正闭管操作等优点，目前已逐渐应用于食品掺假以及产地溯源检测。乳制品等经过加工制造获得的产品，其制造原料中的DNA会受到加工过程的影响而降解成许多小片段，这对扩增引物的设计提出了很高的要求，引物扩增的目标序列太长，容易导致无法获得扩增产物，引物扩增的目标序列太短，则由于扩增产物的熔解温度接近引物二聚体的形成温度，影响HRM分析实验结果。目前尚未见到利用多重PCR结合HRM分析对乳制品等中的不同动物源性成分进行鉴别的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法及试剂盒，通过一次PCR反应，快速、经济、可靠的完成对生乳、乳制品等中山羊、绵羊、牛、水牛等动物源性成分的检测。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，包括以下步骤：1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，设计用于扩增对应动物种类的基因组中某段特异性序列的扩增引物；2)对步骤1)设计的针对不同动物种类的扩增引物进行多重PCR扩增及扩增产物熔解的特异性检验；3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的针对不同动物种类的特异性扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，将该高分辨熔解曲线与以各动物种类基因组DNA为模板并采用所述特异性扩增引物扩增得到的对应产物的高分辨熔解曲线进行比对，根据比对匹配的熔解峰位置确定所述样品中动物源性成分的构成情况。优选的，所述步骤1)中，扩增引物扩增的目的片段在200bp以下，扩增的目的片段位于对应动物种类基因组的特异性保守区域，不同动物种类对应的扩增产物在长度和/或GC比值上存在区别。优选的，所述步骤3)中，经过检验确定的特异性扩增引物选自针对山羊的引物对P1、针对绵羊的引物对P2、针对牛的引物对P3、针对水牛的引物对P4中的两对以上引物；其中，引物对P1的序列为：上游引物：5'-GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCCACCAAAATTCAACACAATACCACAT-3'下游引物：5'-GCGGGCGCCGCCCTGCCCGCAGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'引物对P2的序列为：上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'引物对P3的序列为：上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3'下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3'引物对P4的序列为：上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCGCAA-3'下游引物：5'-CATTGGTCGTGGTTGAATTCCA-3'。优选的，所述多重PCR扩增的反应体系包括DNA模板、引物对P1、P2、P3和P4、PCR反应试剂(例如，2×QIAGENMultiplexPCRMasterMix)、双蒸水以及荧光染料，P1:P2:P3:P4的引物摩尔比为4:9:5:8。优选的，所述多重PCR扩增的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。优选的，所述高分辨熔解的程序为：将多重PCR扩增的产物在闭管条件下从65℃开始以0.05℃/s速率逐渐升温至95℃，同时连续检测荧光强度。优选的，所述样品采集自乳制品或生乳。一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR试剂盒，包括上述针对不同动物种类的特异性扩增引物(例如，P1、P2、P3、P4四对引物)、PCR反应试剂、荧光染料、双蒸水以及对照品(经多重PCR扩增后)对应的高分辨熔解曲线，所述对照品选自不同动物种类(例如，山羊、绵羊、牛和水牛)各自的基因组DNA或对应各动物种类的基因组DNA的组合(例如，1:1:1:1)。优选的，所述试剂盒还包括不同动物种类(例如，山羊、绵羊、牛和水牛)的基因组DNA。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术利用多重PCR扩增，以提取自样品的DNA为模板，在一次PCR反应中同时扩增不同动物源性成分的特异性DNA片段，结合高分辨熔解曲线对扩增的片段进行鉴定，实现了对样品中不同动物源性成分的鉴别，本专利技术不需要针对每种动物源性成分单独进行检测、鉴别，提高了检测效率，降低了检测成本，适用于大规模样品的检测。进一步的，本专利技术选取较短的目的片段进行扩增，消除了乳制品等在加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，设计用于扩增对应动物种类的基因组中某段特异性序列的扩增引物；2)对步骤1)设计的针对不同动物种类的扩增引物进行多重PCR扩增及扩增产物熔解的特异性检验；3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的针对不同动物种类的特异性扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，将该高分辨熔解曲线与以各动物种类基因组DNA为模板并采用所述特异性扩增引物扩增得到的对应产物的高分辨熔解曲线进行比对，根据比对匹配的熔解峰位置确定所述样品中动物源性成分的构成情况。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，设计用于扩增对应动物种类的基因组中某段特异性序列的扩增引物；2)对步骤1)设计的针对不同动物种类的扩增引物进行多重PCR扩增及扩增产物熔解的特异性检验；3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的针对不同动物种类的特异性扩增引物进行多重PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，将该高分辨熔解曲线与以各动物种类基因组DNA为模板并采用所述特异性扩增引物扩增得到的对应产物的高分辨熔解曲线进行比对，根据比对匹配的熔解峰位置确定所述样品中动物源性成分的构成情况。2.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤1)中，扩增引物扩增的目的片段在200bp以下，扩增的目的片段位于对应动物种类基因组的特异性保守区域，不同动物种类对应的扩增产物在长度和/或GC比值上存在区别。3.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的多重荧光PCR方法，其特征在于：所述步骤3)中，经过检验确定的特异性扩增引物选自针对山羊的引物对P1、针对绵羊的引物对P2、针对牛的引物对P3、针对水牛的引物对P4中的两对以上引物；其中，引物对P1的序列为：上游引物：5'-GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCCACCAAAATTCAACACAATACCACAT-3'下游引物：5'-GCGGGCGCCGCCCTGCCCGCAGCGTTATCTTTGTAATAGGTTTTGT-3'引物对P2的序列为：上游引物：5'-CGTAGATGTAGTATGACTTTTCCT-3'下游引物：5'-GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA-3'引物对P3的序列为：上游引物：5'-GTTAACAGCTAAACACCCTAGCT-3'下游引物：5'-AGGTTTGACTCCTCTTTTTACCAA-3'引物对P4的序列为：上游引物：5'-CCAAAATTTAACACAATCCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秦峰，澹台玮，马西亚，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61