一种食品中山羊源成分快速检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种食品中山羊源成分快速检测试剂盒，涉及生物物种鉴定技术领域。本发明专利技术首先筛选出一个山羊源通用内标准基因TSPY，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在山羊物种中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，可作为鉴定山羊源的靶基因。以该基因为靶序列设计了PCR扩增引物，与PCR反应液一起进行扩增，PCR反应产物用于铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测。PCR反应结合基于铂钯纳米颗粒的免疫层析试纸条检测构成快速检测试剂盒，可快速、灵敏地检测食品中的山羊源成分，检测灵敏度可达0.8％(w/w)。本发明专利技术试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于现场实时检测。

A Kit for Rapid Detection of Source Components of Food Zhongshan Sheep and Its Application

The invention provides a fast detection kit for ingredients from food Zhongshan sheep, which relates to the technical field of biological species identification. The present invention firstly screens out a universal internal standard gene TSPY of goat origin, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1. The number of copies of TSPY is constant in goat species, and there is no allele variation. TSPY can be used as a target gene for identifying goat origin. The primers were designed to amplify the Pt-Pd nanoparticle immunochromatographic strip with the target sequence of the gene, which was amplified with the reaction solution of the PCR. The product of the PCR reaction was used to detect the Pt-Pd nanoparticle immunochromatographic strip. A rapid detection kit based on platinum-palladium nanoparticles and immunochromatographic strip was constructed. The kit can detect goat-derived ingredients in food rapidly and sensitively with a detection sensitivity of 0.8% (w/w). The kit has the advantages of simple use method, low cost, easy observation of reaction results and good specificity, and is very suitable for on-site real-time detection.

【技术实现步骤摘要】
一种食品中山羊源成分快速检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物物种鉴定
，具体的说涉及一种检测食品中山羊源成分的聚合酶链式反应技术(PCR)结合铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测的快速检测试剂盒。
技术介绍
随着经济的高速发展，人民生活水平的提高，我国居民对肉类食品的需求逐年增加。尽管许多国家明确规定要求食品标签真实明确地标出肉的种类、来源，禁止掺假行为，但是市场上仍有很多肉类掺假的事件发生，例如为了降低成本，驴肉火烧中掺入了猪肉，羊肉中掺入牛肉或猪肉，香肠中掺杂其他肉类等等行为。目前，PCR方法是检测食品掺假简单有效的方法，其操作简单、时间短、检测准确性高。因此，本专利技术目的是提供一种食品中山羊源成分的快速灵敏检测试剂盒。目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量PCR扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体DNA的浓度无法和基因组DNA的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通PCR实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量PCR实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。PCR方法是目前应用比较广泛的方法，其原理是利用一种DNA聚合酶和一对与模板互补配对的特异性引物，通过一系列的变性、退火、延伸等步骤，使模板DNA总量不断增加的过程。免疫层析试纸是为了实现快速检测而衍生出的一种高精度、低价格、易操作的检测方法，通常由样品垫、结合垫、检测线、质控线、硝酸纤维素膜、吸水垫、背板几部分组成。检测原理与酶联免疫吸附测定类似，但是检测过程更为简单、便携、易于操作。免疫层析试纸有夹心法、竞争法和间接法3种。铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条属于夹心法，其原理是将待测物质的特异性抗体交联到纳米颗粒上以及侧流层析传感器的检测线上，当纳米颗粒-抗体复合物和抗原结合后，该复合物再与检测线上包被的抗体相结合，形成三明治夹心结构。通过观察检测线和控制线颜色的变化实现目视定性检测。铂钯纳米颗粒就是在铂纳米催化剂中引入第二金属元素钯，即在纳米铂颗粒上包裹一层钯，形成具有球壳结构铂钯双金属颗粒。铂钯纳米颗粒具有优越的类辣根过氧化物酶活性，可以在H2O2存在的情况下成功使TMB溶液显现明显的蓝色。因此，本专利技术将铂钯纳米颗粒应用于免疫层析试纸上，以起到增强检测线的作用，极大的提高了检测灵敏度。本专利技术将特异性PCR技术同铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测结合起来，提供一种食品中山羊源成分的快速灵敏检测试剂盒。本专利技术无需复杂的仪器，时间短，操作简单，灵敏度高，只需要一台普通PCR仪就可以满足检测的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于检测食品中山羊源成分的山羊源通用内标准基因。本专利技术另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测食品中山羊源成分的特异性PCR结合铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测的快速检测试剂盒。一种用于检测食品中山羊源成分的基因，其为内标准基因TSPY，具有SEQIDNO.1所示的序列。本专利技术提供了上述内标准基因TSPY在检测山羊源成分中的应用。本专利技术提供了上述内标准基因TSPY在食品中山羊源成分鉴定中的应用。本专利技术提供了一种用于检测上述内标准基因TSPY的特异性PCR引物组合，包括以下2条引物：F：5’-GAGAAGACAGTGGAGGAGCAGT-3’(SEQIDNO:2)；R：5’-GCACATCAACCAAACGTAGGC-3’(SEQIDNO:3)；其中上游引物F的5’端标记生物素(Biotin)，下游引物R的5’端标记荧光素(FITC)。本专利技术提供了上述特异性PCR引物组合在山羊源成分鉴定中的应用。本专利技术提供了上述特异性PCR引物组合在制备山羊源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。进一步地，本专利技术提供一种含有上述特异性PCR引物组合的检测山羊源成分的快速检测试剂盒。本专利技术提供一种检测食品中山羊源成分的方法，包括以下步骤：(1)待测样品提取DNA；(2)以提取DNA为模板，采用权利要求3所述特异性PCR引物组合进行PCR检测；(3)结果判断：采用铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条进行结果判断。检测T线和质控C线均有蓝色条带，含有目的基因；质控C线有蓝色条带，而检测T线无条带，不含有目的基因。上述方法中，步骤(2)所述PCR检测，其25μLPCR检测体系的具体配置为：10×reactionbuffer，0.4mMdNTP，0.2μM引物F，0.2μM引物R，2UTaqPCRpolymerase。上述方法中，PCR检测反应条件为：95℃5min；95℃30s,53℃30s,72℃30s,共30个循环；72℃5min。上述方法中，步骤(3)所述的铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条包含测试线与质控线，测试线标记有FITC抗体，质控线标记有生物素二抗，结合垫有铂钯纳米颗粒-生物素抗体标记物。本专利技术首次在染色体上筛选出山羊源内标准基因。本专利技术用多个品种山羊验证内标准基因，证明该内标准基因稳定，不存在等位基因变异。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的内参基因拷贝数多，不易于定量。本专利技术选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数低，易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。图1为免疫层析试纸示意图。本专利技术利用PCR反应，设计两条引物针对山羊特异性内标准基因靶序列进行基因扩增。然后用铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条检测PCR反应产物。铂钯纳米颗粒免疫层析试纸条测试线(TL)与质控线(CL)分别标记有FITC抗体和生物素二抗，结合垫有铂钯纳米颗粒-生物素抗体标记物。当PCR反应产物滴加到试纸条样品垫时，由于毛细管作用，产物会依次经过结合垫、检测线(TL)、质控线(CL)，由于“抗原-抗体”的特异性结合作用和铂钯纳米颗粒的催化作用，PCR反应产物为阳性时，测试线(TL)与质控线(CL)均有蓝色条带；反应产物为阴性时，则只有质控线(CL)有蓝色条带。免疫层析试纸以“铂钯纳米颗粒-抗体”复合物和“抗原-抗体”识别体系为基础构建了三层夹心结构。在一个标准的检测过程中，将含有山羊源成分的样品和体系缓冲液混合加在样品垫，溶液在毛细管力的作用下会随着侧流层析试纸向上移动并到达结合垫。在结合垫上，含有山羊源的特异PCR产物与溶解的“铂钯纳米颗粒-抗体”复合物中的抗体发生基于“抗原-抗体”的免疫反应，形成“铂钯纳米颗粒-抗体”与抗原结合的新复合物。之后该复合物会沿着免疫层析试纸继续向上移动，当其到达检测线时，PCR产物与检测线上的相应抗体发生第二次基于“抗原-抗体”的免疫反应。因此，含有铂钯纳米颗粒的复合物就会被抓取并堆积于检测线上，生成一条特征性的黑色条带。之后过量的“铂钯纳米颗粒-抗体”复合物会向着质控线迁移，当其到达质控线后，“铂钯纳米颗粒-抗体”功能探针中的抗体会被质控线上羊抗鼠IgG捕获，形成第二条特征性的黑色条带。因铂钯纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测食品中山羊源成分的基因，其为内标准基因，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测食品中山羊源成分的基因，其为内标准基因，具有SEQIDNO.1所示的序列。2.权利要求1所述的基因在检测山羊源成分中的应用。3.权利要求1所述的基因在食品山羊成分鉴定中的应用。4.用于检测权利要求1所述基因的特异性PCR引物组合，包括以下2条引物：F：5’-GAGAAGACAGTGGAGGAGCAGT-3’(SEQIDNO:2)；R：5’-GCACATCAACCAAACGTAGGC-3’(SEQIDNO:3)；其中上游引物F的5’端标记生物素(Biotin)，下游引物R的5’端标记荧光素(FITC)。5.权利要求4所述的特异性PCR引物组合在山羊源成分鉴定中的应用。6.权利要求4所述的特异性PCR引物组合在制备山羊源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。7.一种检测食品中山羊源成分的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)待测样品提取DNA；(2)以提取DNA为模板，采...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，许文涛，黄昆仑，张超，杜再慧，马玉婷，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11