一种快速鉴定食品中鹅源成分的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种快速鉴定食品中鹅源成分的试剂盒，涉及生物物种鉴定技术领域。本发明专利技术首先筛选出一个鹅源通用内标准基因CCNB1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其在鹅物种中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，可作为鉴定鹅源的靶基因。以该基因为靶序列设计了非对称扩增引物，非对称PCR反应产物用于DNA银纳米簇检测。非对称PCR反应结合DNA银纳米簇检测构成快速检测试剂盒，可快速、灵敏地检测食品中的鹅源成分，检测灵敏度可达2％(w/w)。本发明专利技术非对称PCR‑DNA银纳米簇通用荧光试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于现场实时检测。

A Kit for Rapid Identification of Goose Source Components in Food and Its Application

The invention provides a kit for rapid identification of goose source ingredients in food, which relates to the technical field of biological species identification. The present invention firstly screens out a common internal standard gene CCNB1 of goose origin, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1. The number of copies of CCNB1 in goose species is constant, and there is no allele variation. CCNB1 can be used as a target gene for identifying goose origin. Asymmetric amplification primers were designed with this gene as target sequence, and asymmetric PCR products were used to detect DNA silver nanoclusters. Asymmetric polymerase chain reaction combined with DNA silver nanocluster detection constitutes a rapid detection kit, which can quickly and sensitively detect goose-derived ingredients in food with a detection sensitivity of 2% (w/w). The asymmetric PCR DNA silver nanocluster universal fluorescence kit of the invention has the advantages of simple use method, low cost, easy observation of reaction results and good specificity, and is very suitable for on-site real-time detection.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定食品中鹅源成分的试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物物种鉴定
，具体的说涉及一种检测食品中鹅源成分的非对称PCR-DNA银纳米簇快速检测试剂盒。
技术介绍
随着经济的高速发展，人民生活水平的提高，我国居民对肉类食品的需求逐年增加。尽管许多国家明确规定要求食品标签真实明确地标出肉的种类、来源，禁止掺假行为，但是市场上仍有很多肉类掺假的事件发生，例如为了降低成本，驴肉火烧中掺入了猪肉，羊肉中掺入猪肉，鹅中掺杂其他肉类等等行为。目前，对于食品掺假的检测方法主要是PCR加琼脂糖凝胶电泳的方法，最终结果的判断需要借助凝胶成像系统等大型仪器来完成，过程比较繁琐且耗时较长。因此，本专利技术目的是提供一种食品中鹅源成分的快速灵敏检测试剂盒。目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量PCR扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体DNA的浓度无法和基因组DNA的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通PCR实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量PCR实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。非对称PCR是以双链DNA为模板，通过在体系中加入不等量的一对引物，经过循环扩增产生大量单链DNA(single-strandDNA，ssDNA)的技术。该技术是获取单链靶标DNA的重要方法。银纳米簇合成模板包括有机模板和无机模板两类，有机模板主要有DNA和多肽等。以DNA为模板的银纳米簇是通过胞嘧啶与银离子(Ag+)在高结合力下形成DNA-Ag+复合物，然后利用硼氢化钠还原银离子，从而形成的具有高量子产率且激发波长可调的小分子荧光探针。银纳米簇探针与传统的荧光探针相比较，最大的特点是无需荧光基团标记，而且对DNA成核序列有特异性的结合作用，在分子生物学领域具有巨大应用潜能。本专利技术将非对称PCR与DNA银纳米簇相结合，利用非对称PCR扩增出筛选出的特异性内标准基因特异序列，然后设计与单链靶标特异性互补的DNA银纳米簇探针，获得在紫外(365nm)条件下可视的荧光产物，以检测物种成分和鉴定物种来源。本专利技术操作简单，无需凝胶电泳等繁琐的检测，灵敏度高，完全满足食品中鹅源成分快速检测的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于检测食品中鹅源成分的鹅源通用内标准基因。本专利技术另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的检测食品中鹅源成分的非对称PCR-DNA银纳米簇快速检测试剂盒。一种用于检测食品中鹅源成分的基因，其为内标基因CCNB1，具有SEQIDNO.1所示的序列。本专利技术提供了上述内标准基因CCNB1在检测鹅源成分中的应用。本专利技术提供了上述内标准基因CCNB1在食品中鹅源成分鉴定中的应用。本专利技术提供了一种用于检测上述内标准基因CCNB1的特异性非对称PCR引物组合，包括以下两条引物，F为非限制引物，R+polyC为限制引物R的5’端连接DNA-银纳米簇激发序列polyG的反向互补序列polyC：F：TTCCTCAACTGAAAACGCTA(SEQIDNO.2)；R+polyC：CCCCACCCCACCCCACCCTTGGCTCAAACAATTACAATG(SEQIDNO.3)。本专利技术提供了上述特异性非对称PCR引物组合F和R+polyC在鹅源成分鉴定中的应用。本专利技术提供了上述特异性非对称PCR引物组合F和R+polyC在制备鹅源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。进一步地，本专利技术提供一种含有上述特异性非对称PCR引物组合F和R+polyC的检测鹅源成分的快速检测试剂盒。本专利技术还提供一种DNA-银纳米簇探针，包括DNA成核序列、银离子(Ag+)和硼氢化钠(NaBH4)，DNA成核序列是：CCCCCTTAATCCCCC(SEQIDNO.4)；DNA探针序列是R：TTGGCTCAAACAATTACAATG(SEQIDNO.5)。本专利技术提供一种检测食品中鹅源成分的方法，包括以下步骤：(1)待测样品提取DNA；(2)以提取DNA为模板，采用权利要求4所述特异性非对称PCR引物组合非限制引物F和限制引物R+polyC进行PCR扩增；(3)非对称PCR产物与DNA银纳米簇探针杂交；(4)结果判断：特异性单链靶标会与探针特异性碱基互补结合并激发探针，其在紫外(365nm)下会产生黄色荧光，样品在阳性。上述方法中，步骤(2)所述非对称PCR检测，其25μL检测体系的具体配置为：1×PCRbuffer，0.4mMdNTP，0.8μM引物F，0.08μM引物R+polyC，1.5UrTaqDNApolymerase。上述方法中，非对称PCR检测反应条件为：95℃预变性5min；45个循环：95℃30min，53℃30s，72℃30s；72℃延伸10min。本专利技术首次在染色体上筛选出鹅源内标准基因。本专利技术用多个品种鹅验证内标准基因，证明该内标准基因稳定，不存在等位基因变异。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的内参基因拷贝数多，不易于定量。本专利技术选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数低，易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。图1为银纳米簇荧光可视传感器的原理。首先提取物种的基因组(步骤1)。本专利技术选取C5-C5型DNA成核序列，该成核序列形成的DNA-银纳米簇在激发序列polyG激发下会在紫外(365nm)条件下产生黄色荧光。非对称PCR中非限制引物浓度远大于限制性引物浓度，在反应的前10-15循环过程中，非对称PCR与普通定性PCR相同，产生DNA双链。当体系中限制性引物消耗完后，非限制性引物以前10-15循环中产生的DNA双链为模板产生大量的DNA单链。通过在非对称PCR实验中限制引物R的5’端连接DNA-银纳米簇激发序列polyG的反向互补序列polyC，利用非对称PCR实验(步骤2)可产生大量3’末端为下游引物R反向互补序列R’与激发序列polyG的单链靶标。步骤3为非对称PCR产物与DNA-银纳米簇探针杂交过程。将DNA-银纳米簇探针的杂交链设计为与下游引物R相同的序列，如果样品为阳性，则经过步骤2产生的特异性单链靶标会与探针特异性碱基互补结合并激发探针，使其在紫外(365nm)下会产生黄色荧光。本专利技术将鹅肉肉末与非鹅肉肉末进行等质量的混合，检测非对称PCR-DNA银纳米簇方法的灵敏性。结果显示，当混合梯度为50倍(混合肉末质量为鹅肉肉末质量的50倍)即为初始质量的2％时，颜色为浅红色，故本专利技术DNA银纳米簇通用荧光试剂盒的检测限为2％(w/w)。基于本专利技术确定的用于检测食品中鹅源成分的内标准基因CCNB1，本专利技术设计了用于检测该基因的非对称PCR引物组合，应用非特异PCR反应结合DNA银纳米簇可检测待测样品中是否有鹅源成分，此反应快速，费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测食品中鹅源成分的基因，其为内标准基因，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测食品中鹅源成分的基因，其为内标准基因，具有SEQIDNO.1所示的序列。2.权利要求1所述的基因在检测鹅源成分中的应用。3.权利要求1所述的基因在食品鹅成分鉴定中的应用。4.用于检测权利要求1所述基因的特异性非对称PCR引物，包括以下两条引物，F为非限制引物，R+polyC为限制引物R的5’端连接DNA-银纳米簇激发序列polyG的反向互补序列polyC：F：TTCCTCAACTGAAAACGCTA(SEQIDNO.2)；R+polyC：CCCCACCCCACCCCACCCTTGGCTCAAACAATTACAATG(SEQIDNO.3)。5.权利要求4所述的特异性非对称PCR引物组合F和R+polyC在鹅源成分鉴定中的应用。6.权利要求4所述的特异性非对称PCR引物组合F和R+polyC在制备鹅源成分检测试剂盒或检测试剂中的应用。7.一种DNA-银纳米簇探针，其特征在于，包括DNA成核序列、银离子(Ag+)和硼氢化钠(NaBH4)，DNA成核序列是：CCCCCTTAATCCCCC(...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，许文涛，黄昆仑，张超，杜再慧，马玉婷，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11