一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用，涉及基因工程技术领域，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明专利技术还提供了该启动子的制备方法，含有该启动子的载体和表达盒。本发明专利技术提供的启动子能引导报告基因在植物非分泌型腺毛中特异表达，对利用植物非分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Promoter of a regulatory gene expressed in non-secretory trichome and its application

The invention discloses a promoter regulating gene expression in non-secretory glandular hairs and its application, which relates to the field of genetic engineering technology. The nucleotide sequence of the promoter is shown as SEQ ID NO.1. The invention also provides a preparation method of the promoter, a carrier and an expression box containing the promoter. The promoter provided by the invention can guide the specific expression of the reporter gene in plant non-secretory glandular hairs, and is of great significance for gene engineering breeding of utilizing plant non-secretory glandular hairs to express and produce metabolites.

【技术实现步骤摘要】
一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用。
技术介绍
青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、挥发油、α-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含有黄酮类化合物。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandulartrichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎秆、花上都大量存在分泌型腺毛，这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用。莰烯是一种双环单萜烯类化合物，存在许多香精油内。莰烯是一种多用途的中间体，除用于乙酸异龙脑酯、合成樟脑外，近年来被广泛应用于合成檀香、香料及农药制造。莰烯合成酶是青蒿中催化崁烯生物合成过程中的关键酶。启动子是位于结构基因5’端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子。这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于非分泌型腺毛特异表达的启动子只对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物造成代谢的浪费和生长发育造成危害。因此，克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。因此，本领域的技术人员致力于开发植物腺毛组织特异表达的启动子。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种植物腺毛组织特异表达的启动子，其可以用于研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。为实现上述目的，本专利技术提供了一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子及其应用，具体为一种青蒿崁烯合成酶基因启动子。在一个具体实施方式中，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，该启动子为特异型启动子。进一步地，该启动子的顺式作用元件包括：TATAbox、CAATbox、G-box、ARE、GA-motif、G-Box和MBS等，所述启动子能够代替组成型启动子引导外源基因在植物分泌型腺毛中特异表达，启动子序列中调控元件见下表1：表1启动子序列中调控元件分析本专利技术提供一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用，对植物的腺毛系统进行遗传操作，其使用如上所述的启动子本专利技术提供一种表达盒，所述表达盒连接有如上所述的启动子。本专利技术提供一种载体，所述载体连接有如上所述的启动子。本专利技术提供的启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，制备方法包括以下步骤：步骤一、培养青蒿无菌苗；步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；步骤七、PCR检测转基因植株；步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增分泌型腺毛特异启动子序列。进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如下所示：PstI-Pro-PDR1-FP：GACTGCAGAAGATCTTCGCCTACAACCAPro-PDR1-BamHI-RP：CGGGATCCGTTAACTCACAATCAAGAT进一步地，所述步骤六具体包括：1)外植体的预培养；2)农杆菌与外植体的共培养；3)抗性再生植株的筛选。技术效果经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本专利技术基因启动子序列相关的报道，由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术利用有效的青蒿表皮毛组织特异性启动子代替组成型启动子，可以用于构建在分子生物学中在青蒿非分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作，获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。附图说明图1是本专利技术的一个实施例中转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；图2是本专利技术的一个实施例中利用青蒿腺毛特异性基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z–proCAM通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术进行详尽说明，以下实例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术而不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本专利技术的保护范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105，质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。实施例1青蒿莰烯合成酶基因启动子(proAaCAM)的获得具体包括如下步骤：步骤一、培养青蒿无菌苗青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆1、基因组DNA的提取在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片(1cm2左右大小，用冰盒盛取)，加入2粒钢珠。加入300μLTPSbuffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90秒。再加入300μLTPSbuffer(通风橱)。65℃水浴1h(每隔20min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h。冷却至室温，4℃10000rpm离心15min。取300μL-400μL上清液。加入300μL-400本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为特异型启动子。3.如权利要求2所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子上面的顺式作用元件包括：TATAbox、CAATbox、G-box、ARE、GA-motif、G-Box和MBS等。4.如权利要求1所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。5.一种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子。6.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒连接有如权利要求1所述的调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子。7.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，制备方法包括以下步骤：步骤一、培养青蒿无菌苗；步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；步骤三、分析调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；步骤四、将克隆到的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静雅，严振宁，马嘉伟，付雪晴，钱虹妹，孙小芬，唐克轩，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31