本发明专利技术涉及一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子，所述双向启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本启动子来源于一种地衣芽孢杆菌基因组，通过转录组分析预测方法获得；在新型启动子pLA和其反向启动子pLB调控转录下，克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164U/mL和111U/mL，正义链启动子比已知强组成型启动子pShuttle‑09的表达活性提高了44％；从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向，并推动蛋白酶的高效表达及工业化。
A Bidirectional Promoter, Application, Plasmid and Genetically Engineered Bacteria Expressing Alkaline Protease
The present invention relates to a bidirectional promoter capable of expressing alkaline protease. The nucleotide sequence of the bidirectional promoter is SEQ ID NO:1. The promoter was derived from the genome of Bacillus licheniformis and was obtained by transcriptome analysis and prediction. Under the regulation of transcription by pLA and its reverse promoter pLB, the expression activity of alkaline protease of Bacillus Claudius reached 164 U/mL and 111 U/mL, and the expression activity of justice chain promoter was 44% higher than that of pShuttle_09, a known strong constitutive promoter. The expression of heterologous genes in Bacillus spp. expression system provides a new direction and promotes the efficient expression and industrialization of protease.
【技术实现步骤摘要】
一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子、应用、质粒和基因工程菌
本专利技术属于微生物基因工程
，尤其是一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子、应用、质粒和基因工程菌。
技术介绍
碱性蛋白酶(alkalineprotease)，是一类能够在碱性条件下水解蛋白质为氨基酸的蛋白酶，最早发现于猪的胰脏中。目前碱性蛋白酶的主要来源为微生物提取，研究和应用较多的主要是芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌为最。碱性蛋白酶的应用相当广泛，在洗涤剂工业、食品加工工业、医药行业、皮革制造工业、丝绸制造工业、环境保护工业中都有应用和研究。目前国外99％以上洗涤剂均添加了碱性蛋白酶，我国洗涤行业中加酶洗涤剂也占90％以上，而世界上约50％份额的酶制剂是利用芽孢杆菌自身或外源表达产生的。芽孢杆菌表达系统具有很强的蛋白质分泌功能，分泌的外源蛋白不易形成包涵体，无显著的密码子偏爱性，外源蛋白可直接分泌，易于分离纯化等诸多优点。芽孢杆菌表达系统在分泌和表达活性蛋白上的优点逐渐引起人们的关注，有可能成为继大肠杆菌之后的重要的原核表达系统。外源蛋白在芽孢杆菌中的高效表达是实现其在工业应用上的重要途径，而使用强并可控制的启动子是外源蛋白高效表达的关键因素之一，决定着工业生产酶的大规模生产。启动子是指可与RNA聚合酶结合以起始转录的DNA序列区域。它是与RNA聚合酶结合的靶序列，对一个基因(或转录单元)的转录是否开始以及在什么条件下开始起到决定性的控制作用。使用强启动子介导碱性蛋白酶基因的表达是提高蛋白酶产量非常有效的方法。双向启动子是指位于一对“头对头”的基因的两个TSSs之间的启动子，GC含量丰富，可分别驱动正链与负链下游结构基因表达的基因组序列。双向启动子在真核生物基因组中广泛分布，而在原核生物中则鲜有报道。常用的原核生物双向启动子是DidierMaZel等在霍乱弧菌中发现的Pc/Pint。廖昱泓等发现真核生物酵母基因中的双向启动子即MAL1基因启动子区在原核生物大肠杆菌中仍具有双向启动的功能。DidierMaZel等在霍乱弧菌中发现的Pc/Pint是较常用的来源于原核生物的双向启动子。目前，国内外由基因组中筛选获取新型启动子的方法主要包括运用启动子探针载体筛选和基因组分析预测等。碱性蛋白酶市场需求大而目前的工程菌株产酶效率不高，因此进一步发展和完善芽孢杆菌表达系统，不断完善和扩大芽孢杆菌载体系统和宿主系统，对碱性蛋白酶的工业化生产以及其他异源基因的表达都具有重要意义。通过检索，尚未发现与本专利技术申请相关的专利技术公开文献。
技术实现思路
本专利技术目的在于现有技术的不足之处，提供一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子、应用、质粒和基因工程菌，该启动子来源于一种地衣芽孢杆菌基因组，通过转录组分析预测方法获得；在新型启动子pLA和其反向启动子pLB调控转录下，克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164U/mL和111U/mL，正义链启动子比已知强组成型启动子pShuttle-09的表达活性提高了44％；从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向，并推动蛋白酶的高效表达及工业化。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子，所述双向启动子的核苷酸序列为SEQIDNO：1。而且，所述序列为用作表达克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因alk的启动子。如上所述的能够表达碱性蛋白酶的双向启动子在作为启动子方面的应用。一种含有如上所述的能够表达碱性蛋白酶的双向启动子的质粒。而且，所述质粒的核苷酸序列为SEQIDNO：4。一种含有如上所述的质粒的基因工程菌。本专利技术取得的优点和积极效果为：1、本专利技术启动子为一种能够表达碱性蛋白酶基因的双向启动子，该启动子来源于一种地衣芽孢杆菌基因组，通过转录组分析预测方法获得；在新型启动子pLA和其反向启动子pLB调控转录下，克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164U/mL和111U/mL，正义链启动子比已知强组成型启动子pShuttle-09的表达活性提高了44％；从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向，并推动蛋白酶的高效表达及工业化。2、本专利技术采用转录组测序结果分析鉴定的方法，由地衣芽孢杆菌基因组中筛选获得一种新型双向启动子。该双向启动子可以在枯草芽孢杆菌WB600中同时表达两段基因。双向启动子正义链的启动强度约为pShuttle-09的1.44倍。本专利技术启动子在用于提高外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达具有较好的效果。3、本专利技术通过转录组测序数据分析鉴定的方法进行启动子筛选，获得的新型启动子pLA对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164U/mL，比已知强组成型启动子pShuttle-09的表达活性提高了44％，反义链启动子pLB表达活性为111U/mL。4、本专利技术中的双向启动子即在地衣芽孢杆菌转录组测序结果的基础上，运用生物信息学等分析获得的lichenicidinprepeptideLanA基因的启动子pLA/pLB。附图说明图1为本专利技术中重组表达载体的构建过程图；图2为本专利技术中重组载体各片段回收验证图；其中，M：核酸分子量标准；1：pShuttle-09；2：pLA；3：pLB；4：alk；5：pLA-Alk；6：pLB-Alk；7：pS-Alk；8：pWH1520；图3为本专利技术中三种重组工程菌株对蛋白质的分解能力图(24h)；图4为本专利技术中三种启动子对alk基因的表达活性图；图5为本专利技术中启动子pLA结构图；图6为本专利技术中启动子pLB结构图；图7为本专利技术中启动子pShuttle-09结构图。具体实施方式下面详细叙述本专利技术的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本专利技术中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。本专利技术所选用的宿主菌可以为胞外碱性蛋白酶无活性的枯草芽孢杆菌WB600。本专利技术将地衣芽孢杆菌在三角瓶中发酵培养，每隔12h进行取样，对蛋白酶表达量较高的样品进行转录组测序分析；对转录组测序结果进行分析，通过NCBI数据库比对获得该表达量最高的结构基因的上游500bp的基因序列，设计PCR引物；提取地衣芽孢杆菌基因组，并以此为模板PCR扩增启动子；使用大肠-枯草芽孢杆菌穿梭载体pWH1520，分别以三种启动子pShuttle-09和pLA、pLB为表达调控元件，克劳氏碱性蛋白酶基因为报告基因，构建蛋白酶基因表达载体；将构建好的重组表达载体转化进入枯草芽孢杆菌WB600，获得重组基因工程菌，牛奶板筛选并发酵检测其酶活性；通过在线软件BPROM对该启动子进行结构分析，与启动子pShuttle-09进行结构对比，分析表达活性提高的原因。相关过程可以如图1所示。培养基和酶活测定方法：种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L。枯草芽孢杆菌感受态制备培养基：电转化感受态制备重悬液(溶液A)：D-山梨醇0.5mol/L，D-甘露醇0.5mol/L，甘油10％，加去离子水定容，121℃灭菌20min。电转化复苏液(溶液B)：蛋白胨10g/L本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子，其特征在于：所述双向启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种能够表达碱性蛋白酶的双向启动子，其特征在于：所述双向启动子的核苷酸序列为SEQIDNO：1。2.根据权利要求1所述的能够表达碱性蛋白酶的双向启动子，其特征在于：所述序列为用作表达克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因alk的启动子。3.如权利要求1或2所述的能...
【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，柴昊男，张会图，袁飞燕，刘焕，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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