一种海藻内源温度诱导型启动子及其应用制造技术

本发明专利技术属于海藻基因工程技术领域，涉及一种海藻内源温度诱导型启动子及其应用。启动子含共存的高温热激元件HSE和低温冷激元件LTR。本发明专利技术采用染色体步移、基因克隆、DNA测序等技术得到大型海藻浒苔热激蛋白70基因(hsp70)启动子，具有SEQ ID NO:1所示的序列；进一步通过缺失突变和遗传转化鉴定了启动子内负责高、低温响应的顺式元件及其互作机制；在此基础上将克隆的热激蛋白70基因启动子插入报告基因GUS上游，构建转化载体导入浒苔叶状体检测到外源基因GUS基因的温度诱导表达。该技术可以提高浒苔转基因的可控性和生物安全性，对藻种的品种改良以及基因工程产品开发都具有重要意义。

An Endogenous Temperature-Induced Promoter from Algae and Its Application

The invention belongs to the field of algae genetic engineering technology, and relates to an endogenous temperature-inducible promoter of algae and its application. The promoter contains coexisting high temperature heat shock element HSE and low temperature cold shock element LTR. The promoter of heat shock protein 70 gene (hsp70) of Enteromorpha prolifera was obtained by chromosome walking, gene cloning, DNA sequencing and other techniques, which has the sequence shown by SEQ ID NO:1. The cis-elements responsible for high and low temperature response in the promoter and their interaction mechanism were further identified by deletion mutation and genetic transformation; on this basis, the cloned promoter of heat shock protein 70 gene was inserted. The temperature-induced expression of GUS gene was detected in the thallus of Enteromorpha proliferata by constructing a transformation vector upstream of GUS gene and introducing it into the thallus of Enteromorpha proliferata. This technology can improve the controllability and biosafety of Enteromorpha prolifera, and is of great significance to the improvement of algae species and the development of genetic engineering products.

【技术实现步骤摘要】
一种海藻内源温度诱导型启动子及其应用
本专利技术属于海藻基因工程
，涉及一种海藻内源温度诱导型启动子及其应用。
技术介绍
大型海藻属于低等植物，主要包括绿藻、褐藻与红藻。其中许多经济种类已实现规模化人工栽培，例如绿藻类的浒苔、石莼与礁膜，褐藻类的海带、裙带菜、羊栖菜，以及红藻类的紫菜、红毛菜、江蓠、石花菜和麒麟菜。目前全球大型海藻栽培总面积超过三百万亩，年产量超过600万吨鲜重，除部分作为营养食品外，也用于碘、甘露醇、藻胶等重要化工原料、以及海洋药物与蛋白试剂的提取原料，具有很高的经济价值。以大型海藻为对象建立遗传操作技术，既可以改变其经济性状，获得抗病抗逆的藻类新品种、提高产量和质量等，也可以将其开发成为具有海洋特色的表达系统，低成本地生产高附加值产品，如口服疫苗和药物等。大型海藻表达系统与其他表达系统(如大肠杆菌、酵母、哺乳动物和高等植物)相比，具有光合自养成本低廉、不占用耕地、养殖密度大等优势，并有着突出的海洋特色。为了实现上述目标，迫切需要发展高效、安全的海藻基因工程技术与全套方法。其中，针对导入基因的高效、安全和可控表达，启动子是一个重要的载体元件。启动子根据调控方式的不同，又分为组成型、诱导型和组织特异型启动子。诱导型启动子是基因工程研究中的重要元件。与组成型启动子相比，诱导型启动子不仅能高效启动外源基因的表达，而且还能够精确调控外源表达的持续时间；与组织特异型启动子相比，诱导型启动子不会局限在特定的组织表达，具有应用的广泛性。目前基因工程研究以及商业化使用最广泛的大肠杆菌乳糖操纵子就属于这类启动子。因此，对于大型海藻基因工程来说，开发内源诱导型启动子非常重要。
技术实现思路
针对海藻基因工程对藻类自身来源诱导型启动子的需求，本专利技术的目的是提供一种海藻内源温度诱导型启动子及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种海藻内源温度诱导型启动子，启动子含共存的高温热激元件HSE和低温冷激元件LTR。所述高温热激元件HSE为浒苔热激蛋白70基因起始密码子ATG上游-179至-167所示的核苷酸；所述低温冷激元件LTR为浒苔热激蛋白70基因起始密码子ATG上游-999至-994所示的核苷酸。所述启动子为SEQIDNO:1所示核苷酸序列；对SEQIDNO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得；或，与序列表中SEQIDNO:1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。所述启动子系从海洋绿藻中获得。所述启动子系从石莼属(Ulva)植物浒苔(Ulvaprolifera)中获得。一种海藻内源温度诱导型启动子的应用，所述启动子在高(35-40℃)、低温(10℃)双向调控进行诱导高效表达中的应用。所述启动子在浒苔遗传育种中的应用。所述启动子在海藻品质改良和构建海藻表达系统中的应用。进一步的说，利用分子生物学的染色体步移(genomewalking)技术、基因克隆技术、DNA测序技术克隆一种浒苔内源温度诱导型热激蛋白70基因启动子phsp70并测定其序列；进一步，通过缺失突变和遗传转化鉴定了启动子内负责高、低温响应的顺式元件及其互作机制；在此基础上，利用克隆技术将所克隆的phsp70启动子序列插入到β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因或草丁膦抗性基因(bar)的上游，构建了系列浒苔转化载体，经转化，可实现导入外源基因在高、低温诱导下的高效表达。一种海藻内源温度诱导表达基因的重组载体，所述重组表达载体的启动子含任意一项所述的温度诱导型启动子。所述重组表达载体的启动子由SEQIDNO:1中核苷酸序列所示。上述重组表达载体的骨架载体为能够在大肠杆菌中复制，含有大肠杆菌可识别的复制起点，启动子，抗性标记基因(例如氨苄青霉素抗性基因)，还包括多酶切位点，可供插入浒苔中使用的表达框(启动子-目的基因或选择标记基因bar-终止子)；例如pBI221，pSV-bar，pSV-β-GalactosidaseControl等。一种海藻内源温度诱导表达基因的重组载体的应用，所述载体经转化在实现导入外源基因于高、低温诱导下的高效表达中的应用。与现有方法相比，本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术通过染色体步移技术(GenomeWalking)得到浒苔热激蛋白70基因上游片段，经启动子功能验证后进一步设计了特异性扩增引物，可有效获得浒苔热激蛋白70启动子。2.在海藻转基因研究或应用中使用浒苔内源的热激蛋白70基因启动子，可以替代目前使用的动物病毒(如SV40、CMV)以及高等植物病毒(CaMV35S、AMT)来源的启动子，完全避免病毒核酸序列的引入，具有更高的生物安全性，有利于将来转基因海藻的应用。3.热激蛋白70是一个温度诱导型表达的蛋白，热激蛋白70基因启动子是一个温度诱导型且高效表达的调控元件，用浒苔热激蛋白70基因启动子构建海藻转基因载体，其驱动外源基因的表达效率不仅显著提高，而且还具有启动效率可控的优势。4.本专利技术通过缺失突变鉴定了启动子内负责高、低温响应的顺式元件，明确了其互作机制，发现HSE元件与LTR元件共存的情况下，可以实现对高温和低温诱导的双向响应，二者间具有协同作用，这一点和其他生物中同样使用hsp70启动子的现有技术显著不同。附图说明图1为本专利技术实施例提供的浒苔热激蛋白70基因5’上游序列生物信息学分析图。图2为本专利技术实施例提供的浒苔转化载体pUP70-GUS、pUP70HD-GUS、pUP70LD-GUS和pBI221示意图。图3为本专利技术实施例提供的浒苔转化phsp70-GUS的定量检测结果。图4为本专利技术实施例提供的浒苔转化phsp70-GUS、pUP70HD-GUS和pUP70LD-GUS的定量检测结果。图5为本专利技术实施例提供的浒苔转化载体pUphsp70-bar构建示意图。图6为本专利技术实施例提供的浒苔转化pUphsp70-bar的草丁膦抗性藻株的PCR检测结果。M：DNAMarker；1-11：35℃高温诱导组；12-19：10℃低温诱导组；20-23：25℃常温培养组；24：阴性对照组。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术的元件及该元件所达到的效果作进一步详细说明。本专利技术浒苔内源温度诱导型热激蛋白70基因启动子序列及其在获得转基因海藻中的应用；可有效提高转基因效率和生物安全性，对藻种的品种改良以及基因工程产品开发具有重要意义。实施例1：浒苔(U.prolifera)内源温度诱导型热激蛋白70基因启动子phsp70的克隆、测序与生物信息学分析1.浒苔热激蛋白70基因5’上游序列的克隆与测序利用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒按照常规方式制备浒苔总DNA模板，经0.8％的琼脂糖电泳检测，提取的浒苔基因组DNA条带清晰完整，可以满足PCR扩增需要。利用TaKaRa公司的(GenomeWalkingKit)染色体步移试剂盒，针对浒苔内源温度诱导型热激蛋白70基因的5’上游序列，设计三条特异性引物(SP1:5’-CACGAATGCTGGATGAACGCAC-3’；SP2:5’-CAACCAGCGACCACAAACCAGG-3’；SP3:5’-TGATGGTGCGGACTGCGGGATT-3’)，根据试剂盒说明书进行染色体步移，将扩增得到的片段进行琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海藻内源温度诱导型启动子，其特征在于：启动子含共存的高温热激元件HSE和低温冷激元件LTR。

【技术特征摘要】
1.一种海藻内源温度诱导型启动子，其特征在于：启动子含共存的高温热激元件HSE和低温冷激元件LTR。2.按权利要求1海藻内源温度诱导型启动子，其特征在于：所述高温热激元件HSE为浒苔热激蛋白70基因起始密码子ATG上游-179至-167所示的核苷酸；所述低温冷激元件LTR为浒苔热激蛋白70基因起始密码子ATG上游-999至-994所示的核苷酸。3.按权利要求1或2海藻内源温度诱导型启动子，其特征在于：所述启动子为SEQIDNO:1所示核苷酸序列；对SEQIDNO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得；或，与序列表中SEQIDNO:1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。4.一种权利要求1所述的海藻内源温度诱导型启动子的应用，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜鹏，吴春辉，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37