用于富集低频DNA突变的DNA探针应用于多种突变的同时检测制造技术

本发明专利技术公开了用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用。该探针具有如下序列的至少之一：1)SEQ ID NO:1～6所示的核苷酸序列；以及2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。该探针可以同时检测对待测核酸样品中变异频率极低的突变，即EGFR基因19外显子上的多种缺失突变，进行特异性的富集，进而实现上述低频突变的特异性检测。

DNA probe for enriching low-frequency DNA mutations for simultaneous detection of multiple mutations

The invention discloses a DNA probe for enriching low-frequency DNA mutation and its application. The probe has at least one of the following sequences: 1) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:1-6; and 2) at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, and at least 99% identical nucleotide sequences compared with 1). The probe can simultaneously detect mutants with very low mutation frequency in nucleic acid samples, i. e. multiple deletion mutants in exon 19 of EGFR gene, and enrich them specifically, so as to realize the specific detection of the above low-frequency mutations.

【技术实现步骤摘要】
用于富集低频DNA突变的DNA探针应用于多种突变的同时检测
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用，更具体地，本专利技术涉及用于富集低频DNA突变的DNA探针、探针在制备试剂盒中的用途、试剂盒、富集低频DNA突变的方法以及检测低频DNA突变的方法。
技术介绍
肺癌有很高的发病率和死亡率，它的发病率在美国是第二位，在中国是第一位，死亡率在美国和中国都是第一位。除了吸烟者，很多从未吸烟的人因为遗传和环境的因素也患有肺癌。肺癌患者中有85-90％的病例是非小细胞肺癌。近年来经大量研究，科学家对于这一类肺癌患者所携带的基因突变情况也有了更为清楚的认识。人类表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)稳定表达于多种上皮组织以及间质和神经元组织中，对细胞的生长、分化的调节有重要作用。当表皮生长因子(EGF)与EGFR结合时，可以使EGFR的胞内区活化，并且激活多种媒介物质，启动繁杂的信号通路。因此，EGFR成为肿瘤尤其是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点。目前，临床上针对肺癌EGFR的靶向治疗，主要包括小分子酪氨酸激酶抑制剂，如贝达药业的埃克替尼(凯美纳)，阿斯利康公司的吉非替尼(易瑞沙)等。研究表明，肺癌患者的EGFR基因编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，而这些突变与埃克替尼和吉非替尼等药物的临床疗效有关，即小分子酪氨酸激酶抑制剂能够竞争性抑制ATP与EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的结合，进而影响酪氨酸残基的磷酸化，抑制EGFR下游信号转导。目前，虽然已经在EGFR基因外显子18-21上发现不下30种突变，但85％-90％的突变都是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变。与EGFR21号外显子上的L858R点突变不同，19号外显子上的缺失突变存在近30种类型，有研究表明，尽管19号外显子的缺失突变类型不同，但大部分都能够响应靶向药物。因此，对多种EGFR19外显子的突变进行检测对于肺癌患者来说至关重要。因此，对于EGFR19外显子的突变的检测技术仍需要进一步开发和改进。
技术实现思路
本专利技术目的是至少在一定程度上解决相关的技术问题之一。为此，本申请的专利技术人设计了一组DNA探针，对微量血液或其他体液游离DNA突变进行特异性的捕获富集，能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤DNA变异。利用该探针检测肺癌患者EGFR基因19外显子上的多种缺失突变类型，并且实现多种突变类型的同时检测。同时，专利技术人还提出了一种无创、高灵敏度、高特异性的同时检测肺癌患者EGFR19外显子多种突变类型的检测方法，通过使用特殊设计的DNA探针，对肺癌患者外周血或其他体液游离DNA(cfDNA/ctDNA)中的EGFR19外显子突变进行特异性的富集，能够应用在肺癌患者靶向用药指导，靶向治疗期间的动态监控等。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种用于富集低频DNA突变的DNA探针。根据本专利技术的实施例，所述探针具有如下序列的至少之一：1)SEQIDNO:1～6所示的核苷酸序列；以及2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。atgttttgat(SEQIDNO:1)。gatgtcttga(SEQIDNO:2)。ctttcgattcc(SEQIDNO:3)。gttggttcct(SEQIDNO:4)。cggagattcc(SEQIDNO:5)。cggaaccttg(SEQIDNO:6)。根据本专利技术的实施例，上述探针可以同时检测对待测核酸样品中变异频率极低的突变-EGFR基因19外显子上的多种缺失突变进行特异性的富集，进而实现上述低频突变的特异性检测。同时，上述探针在同时进行特异性富集时不会形成二聚体，进而检测灵敏度高。根据本专利技术的实施例，上述探针还可以包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述探针具有LNA修饰。LNA可以与互补单链核苷酸杂交，亲和性比相应的寡核苷酸高得多，形成的杂交物的解链温度都很高。根据本专利技术实施例的探针具有更好的热稳定性和生物学活性。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第九位核苷酸以及第十核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸以及第七位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上。根据本专利技术的实施例，所述探针5’端具有生物素标记。结合有生物素的探针可后续与链霉亲和素磁珠结合，进而进行磁珠纯化，进一步提高对低频DNA突变的富集的特异性。根据本专利技术的实施例，所述探针3’端具有磷酸修饰。探针的3’端进行磷酸修饰能阻止该探针在PCR过程中进行错误的延伸根据本专利技术的实施例，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生突变的样本。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2235-2249del15突变的样本。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2236-2250del15突变的样本。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2257del18突变的样本。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2239-2248>C突变的样本。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2254del15突变的样本。根据本专利技术的实施例，所述探针具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2237-2255>T突变的样本。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了前面所述的富集低频DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于富集低频DNA突变的DNA探针，其特征在于，所述探针具有如下序列的至少之一：1)SEQ ID NO:1～6所示的核苷酸序列；以及2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于富集低频DNA突变的DNA探针，其特征在于，所述探针具有如下序列的至少之一：1)SEQIDNO:1～6所示的核苷酸序列；以及2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述探针具有LNA修饰；任选地，所述探针具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上；任选地，所述探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上；任选地，所述探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第九位核苷酸以及第十位核苷酸上；任选地，所述探针具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸以及第七位核苷酸上；任选地，所述探针具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上；任选地，所述探针具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述LNA修饰位于所述探针的第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸以及第九位核苷酸上；任选地，所述探针5’端具有生物素标记；任选地，所述探针3’端具有磷酸修饰。3.根据权利要求1所述的DNA探针，其特征在于，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生突变的样本；任选地，所述探针具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2235-2249del15突变的样本；任选地，所述探针具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2236-2250del15突变的样本；任选地，所述探针具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，所述探针用于富集EGFR基因19号外显子发生C.2240-2257del18突变的样本；任选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：濮悦，林锐，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33