一种产氨肽酶菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物筛选及发酵技术领域，公开了一种产氨肽酶菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8及其应用。所述产氨肽酶菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10974。本发明专利技术筛选得到深海来源的产氨肽酶的菌株Bacillus axarquiensis SWJSX8，其培养条件简单，遗传性质稳定，所产氨肽酶有较强的底物特异性。该菌株可能成为新型氨肽酶的生产菌种或提供新的氨肽酶编码基因。具有良好的研究及应用前景。

A Aminopeptidase-producing Strain Bacillus axarquiensis SWJSX8 and Its Application

The invention belongs to the field of microbial screening and fermentation technology, and discloses an aminopeptidase producing strain Bacillus axarquiensis SWJSX8 and its application. The Aminopeptidase-producing strain Bacillus axarquiensis SWJSX8 was preserved in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Committee on June 10, 2015, and its storage number is CGMCC No. 10974. Bacillus axarquiensis SWJSX8, a strain producing aminopeptidase from deep-sea source, is screened and obtained. The culture condition is simple, the genetic property is stable, and the aminopeptidase produced has strong substrate specificity. The strain may become a new strain producing aminopeptidase or provide a new aminopeptidase coding gene. It has good research and application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种产氨肽酶菌株BacillusaxarquiensisSWJSX8及其应用
本专利技术属于微生物筛选及发酵
，具体涉及一种产氨肽酶菌株BacillusaxarquiensisSWJSX8及其应用。
技术介绍
蛋白酶是一类能够水解蛋白质肽键的酶，与人类的生活息息相关。食物蛋白质经蛋白酶控制酶解可以改善蛋白质的营养特性和功能特性，制备生物活性肽，从而大大提高了蛋白质的应用价值。目前已经有较丰富的商业蛋白酶种类，如木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶等。碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶已被较多研究者报道对水产品、动物蛋白质有较好的水解效果，但这些蛋白酶对植物蛋白质的水解效果并不理想，存在水解度低、蛋白质回收率低、苦味重等问题。这些问题主要是由蛋白酶的酶切位点的限制造成的。蛋白酶根据其作用方式可分为内切蛋白酶和外切蛋白酶：内切蛋白酶主要从肽链的内部切割肽键，生成小分子的多肽；外切蛋白酶分为氨肽酶和羧肽酶，分别从肽链的N端或C端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个释放出来。上述商业蛋白酶除了风味蛋白酶、胰蛋白酶是内切蛋白酶与外切蛋白酶的混合物外，大部分都是内切蛋白酶，作用于植物蛋白质时仅能从内部切割肽键，生成较大分子量的多肽，且使疏水基团大量暴露苦味加重。因此加强外切蛋白酶的开发对提高植物蛋白质的应用有重要意义。微生物来源的氨肽酶一直受到了研究者们的关注。Johnson等于1936年首次从Aspergillusparasiticus的代谢产物中发现了氨肽酶；1996年，Choi等利用Lactobacilluscaseissp.casei产氨肽酶水平为0.16LAP·mL-1左右；张金虎等利用BacilluscereusCZ生产氨肽酶达94.28U·mL-1，江南大学田亚平教授团队选育的枯草芽孢杆菌Zj016产氨肽酶达到5500U·mL-1。已报道的菌株氨肽酶差异比较大，这可能与测定方法和酶活定义单位不同有一定的关系，且不同微生物所产氨肽酶的酶学性质也有较大的区别。本专利技术中涉及的BacillusaxarquiensisSWJSX8野生菌株从深海沉积物中分离得到，经过初步优化培养条件，产氨肽酶的活力在达2.8LAP·mL-1左右，遗传性质稳定。菌属Bacillusaxarquiensis的相关报道还比较少，关于其产氨肽酶的研究在本文是首次报道，可以为氨肽酶产品的开发提供新的生产菌种及理论基础。
技术实现思路
基于以上现有技术，本专利技术的首要目的在于提供一种深海来源、产氨肽酶的微生物菌株BacillusaxarquiensisSWJSX8。本专利技术的另一目的在于提供上述微生物菌株BacillusaxarquiensisSWJSX8在液体发酵产氨肽酶中的应用。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种深海来源、产氨肽酶的微生物菌株BacillusaxarquiensisSWJSX8，该菌株分离自南海深海沉积物样品，采用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵氨肽酶活性测定复筛得到，分类命名为BacillusaxarquiensisSWJSX8。该菌株已于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10974。经形态鉴定及生物生化特性研究，保藏编号为CGMCCNo.10974的菌株在酪蛋白平板上菌落形态如下：菌落呈圆形，直径较小，光滑湿润，边缘整齐，浅黄色，黏稠状；(2)细胞形态：革兰氏染色阳性，杆状，产芽孢；(3)生理生化特征：需氧生长，能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、D-山梨醇和肌醇，不能利用鼠李糖，淀粉水解阳性、明胶液化阳性、甲基红试验阴性、V-P试验阳性、靛基质试验阴性、脲酶阴性、氧化酶阳性，不产H2S。对保藏编号为CGMCCNo.10974菌株的16SrRNA基因进行PCR扩增与序列测定，测得16SrDNA基因片段长度为1440bp，具体序列见序列表。该基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行分析得知，该菌株与数据库中BacillusaxarquiensisstrainBPRIST011相似性最高，同源性达99％，鉴定该菌株为Bacillusaxarquiensis。上述微生物菌株BacillusaxarquiensisSWJSX8在液体发酵产氨肽酶中的应用。本专利技术具有如下优点及有益效果：本专利技术筛选得到深海来源的产氨肽酶的菌株BacillusaxarquiensisSWJSX8，其培养条件简单，遗传性质稳定，所产氨肽酶有较强的底物特异性。该菌株可能成为新型氨肽酶的生产菌种或提供新的氨肽酶编码基因，值得继续加强理论研究和基础应用研究。附图说明图1为不同发酵温度对菌株SWJSX8产氨肽酶的影响曲线图；图2为不同培养基初始pH对菌株SWJSX8产氨肽酶的影响曲线图；图3为不同装液量对菌株SWJSX8产氨肽酶的影响曲线图；图4为不同发酵时间对菌株SWJSX8产氨肽酶的影响曲线图；图5为菌株SWJSX8所产氨肽酶的底物特异性对比图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。富集及种子培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，人工海水1L,pH7.4。酪蛋白培养基：酪蛋白10g，牛肉浸膏3g，磷酸二氢钾2g,琼脂粉15g，人工海水1L,pH7.2左右。发酵培养基：甘油3g，葡萄糖5g,酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵1g，氯化钙1g，海盐10g，pH7.2左右。产氨肽酶的CGMCCNo.10974的分离筛选：富集培养：称取2g深海海泥样品样于50mL灭菌离心管中，加15mL无菌蒸馏水，充分混合，在摇床中振摇30min，静置后取上清液1mL于富集培养基中(25mL/250mL)，37℃，120rpm，培养48h。初筛：取富集后的培养液1mL加入9mL无菌生理水中，用倍比法稀释到不同梯度(10-1-10-7)。选取10-4，10-5，10-6，10-7稀释度，各吸取0.1mL，加入已凝固的酪蛋白培养基中，涂布均匀。倒置放在37℃培养箱中培养24-48h。分离纯化：挑选上述酪蛋白平板中有明显水解圈的菌落，在新的酪蛋白平板上连续划线分离三次以上，直到为纯培养物为止。挑选水解圈较大的单菌落保存于试管斜面上，保藏于4℃冰箱。摇瓶发酵复筛：将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37℃，150rpm，活化12h，以2％接种量接种于发酵培养基中，37℃，150rpm，培养48h。发酵液在4℃，10000rpm离心10min，取上清液即为粗酶液。采用LNA法测定氨肽酶活力，复筛出液体发酵氨肽酶产量高的菌株。氨肽酶活性测定：将粗酶液用pH8.0的Tris-HCl缓冲溶液稀释到合适的浓度，取80μL样品稀释液加入96孔板中，加20μLL-亮氨酸对硝基苯胺(L-leu-pNA)，在40℃准确反应10min后，加入100μL无水乙醇终止反应，测定405nm下的吸光值。以不同浓度对硝基苯胺在405nm下的吸光值绘制标准曲线。40℃每分钟酶解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1μmol对硝基苯胺所需的酶量即为一个酶活单位。产氨肽酶的CGMCCNo.10974的鉴定：将活化的CGMC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产氨肽酶菌株，其特征在于：该菌株为Bacillus axarquiensis SWJSX8，于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10974。

【技术特征摘要】
1.一种产氨肽酶菌株，其特征在于：该菌株为BacillusaxarquiensisSWJSX8，于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵谋明，雷芬芬，赵强忠，苏国万，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44