一株具有促生作用的氢氧化细菌zw-26及其分离方法和应用技术

本发明专利技术公开了一株氢氧化细菌假单胞菌Pseudomonas zw‑26，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018639。本发明专利技术还公开了从不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出该氢氧化细菌的方法，首先是利用持续通H2的培养装置和矿质盐培养基实现对氢细菌的富集、分离和培养，并通过气相色谱法筛选具有较强氧化H2的菌株。分析比较其生长指标，最终筛选出一株能够在重金属胁迫下保护白菜幼苗生长的氢氧化细菌，为氢氧化细菌对植物的促生和保护提供理论依据。

A growth-promoting hydrogen-oxidizing bacterium zw-26 and its isolation method and Application

The invention discloses Pseudomonas zw_26, a hydrogen-oxidizing bacterium, which is stored in a typical culture preservation center in China, and the preservation number is CCTCC NO: M2018639. The invention also discloses a method for isolating and culturing the hydrogen-oxidizing bacteria from rhizosphere soil of leguminous plants without hydrogenase. Firstly, the hydrogen-oxidizing bacteria can be enriched, separated and cultured by continuous H2-permeating culture device and mineral salt culture medium, and the strains with strong H2-oxidizing ability can be screened by gas chromatography. By analyzing and comparing the growth indicators, a hydrogen-oxidizing bacteria was finally screened to protect the growth of Chinese Cabbage Seedlings under the stress of heavy metals, which provided theoretical basis for the growth promotion and protection of plants by hydrogen-oxidizing bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一株具有促生作用的氢氧化细菌zw-26及其分离方法和应用
本专利技术涉及一株氢氧化细菌zw-26及其分离方法和应用，具体涉及一种不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出的氢氧化细菌假单胞菌（Pseudomonas）zw-26，该氢氧化细菌zw-26菌株于2018年9月19日在武汉大学中国典型培养物中心保藏，其保藏编号为CCTCCM2018639。
技术介绍
由于人为的活动，例如自然资源的开采、产品加工制造业、现代农业活动和能源制造，导致释放的重金属对自然环境产生不利的影响。常见的污染物有Cd，Pb，Zn，Cr，Cu等。重金属不像有机物，不能被降解为无害的产物，因此一直存留在环境中，对植物生长和人类的健康构成威胁，急需找到一种高效、绿色环保的方法。通过接种植物促生菌(PGPR)、菌根辅助细菌(MHB)、固氮根际细菌、丛枝菌根真菌(AMF)作为定植者和生物肥料来保护植物免受重金属的毒害已经被报道。这些根际微生物与植物相辅相成，不仅在保护植物免受毒害方面有着重要的角色之外，而且还对植物抵抗重金属的毒害表现出实质性的防御，因而提高植物共生关系及植物的产值。植物与共生根瘤菌的营养物质交换对豆科植物的生长有着重要的作用，豆科植物的轮作效益主要归功于植物的固氮作用，但研究表明只有25%的效益是因为固氮作用。豆科植物在固氮过程中，根瘤周围会产生大量的H2，一些具有吸氢酶的共生根瘤菌（HUP+）能够使氢气被细菌氧化，减少周围土壤中能量的流失，然而许多共生根瘤菌缺失这种酶（HUP-），从而使大量的氢气释放到土壤中，被周围的氢氧化细菌摄取。已有研究表明H2处理过的土壤能够促进植物的生长，植物促生剂是自然环境中的细菌。氢氧化细菌属于植物促生菌，对植物的生长发育有着不可估量的作用，所以其促生机制的探索已成为当前国内外关注的热点，其中氢氧化细菌对重金属的耐受及其对植物的促生少有研究。通过本实验筛选出既能够保护植物免受毒害又能促进植物生长的菌株，以便于研制成为生物肥料菌剂用于农业生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株氢氧化细菌zw-26及其分离培养方法。本专利技术的另一目的是提供上述氢氧化细菌在Cr胁迫下对白菜幼苗的促生作用。本专利技术实现过程如下：一种氢氧化细菌zw-26，其分类命名为假单胞菌属zw-26（Pseudomonassp.zw-26），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo：M2018639。本专利技术氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤如下：(1)样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；(2)土壤富集：将采集的土壤样品置于持续通H2的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；(3)菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；(4)菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。本专利技术的氢氧化细菌zw-26为在28℃的MSA培养基中培养的革兰式阴性杆状细菌。其鉴定特征如下：1、生理生化特征zw-26的生理生化特征显示在表1所述菌株zw-26呈球状，革兰氏染色阴性。在MSA半固体培养基上28℃培养可形成菌落，呈圆形、乳白色。2、序列分析挑取适量单菌落划线至6m1LB培养基中28C,180rpm培养24h，取菌体悬浮液1mL,12000转每分钟离心2min，收集菌体，剩余步骤根据TIANampBacteriaDNAKit说明书依次规范操作，最终获得高纯度的DNA。将部分氢氧化细菌的DNA送上海生工完成16SrDNA扩增及序列测定。提交该细菌的16SrDNA序列到NCBI网站，Blast后获取相似度较高的序列。利用ClustalXl.81将序列进行比对，选择MEGA5.05分子进化遗传分析软件NJ法构建系统发育树。结果显示菌株zw-26与Pseudomonas菌株的序列相似程度达99%，据此可以确定菌株zw-26在分子系统发育分类学上属于Pseudomonas。氢氧化细菌最优菌株的筛选具体包括以下步骤：(1)样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤(2)土壤富集与分离纯化：采集的根际土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养。待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化，将菌株转接斜面培养基，放入密闭干燥器中，按上述通H2的量培养，备用；(3)菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。按照:氧化H2值(mol/L)=密闭试管中初始H2浓度(mol/L)－培养3d后密闭试管中剩余H2浓度(mol/L)，检测菌株是否具有氧化H2能力以及氧化H2能力的大小，筛选出具有较强氧化能力H2的氢氧化细菌一假单胞菌(Pseudomonas)zw-26。上述步骤(1)所述的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草，根际土壤范围为距离根瘤5mm以内。上述步骤(2)所述采集的根际土壤加入无菌水置于锥形瓶中，稀释至10-11，涂布于矿质盐培养基上，倒置在改良的气体培养体系中，氢气含量为1.4mmol，常温下富集培养土壤中的氢氧化细菌。所述的矿质盐培养基：NaNO32.0g，KH2PO40.14g，K2HPO41.2g，酵母膏0.02g，MgSO4·7H2O0.5g，Fe(SO4)·3H2O0.0lg，KCl0.5g，琼脂16g，蒸馏水1L，pH7.2。上述步骤(3)所述的气相色谱条件为：内装5A分子筛的1m×2mm的色谱柱，载气为高纯度N2，流速20mL·min-1，进样口温度：150℃，检测器温度：160℃，检测温度：40℃，分析时间3min。氢氧化细菌制剂的制备(1)菌株：上述分离纯化出的较强氧化能力H2的氢氧化细菌假单胞菌(Pseudomonas)zw-26；(2)发酵培养：接种新鲜的氢氧化细菌到三角瓶，放入摇床，转速180r/min,280C摇瓶培养36h；(3)菌剂制备：以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑、蒙脱土等为吸附剂制成固体菌剂；(4)田间试验：在西北大学试验田进行。设zw-26、营养液、空白对照3个处理，每个处理用土埂隔开。每隔5天调查促生效果。本专利技术还提供了含有氢氧化细菌zw-26或其产生的次级代谢产物的微生物制剂。可以使用本领域熟知的方法将本专利技术的氢氧化细菌制剂配制成植物生长促进剂或植物病原生长抑制剂，但本专利技术并不局限于此。为替代化肥，本专利技术的氢氧化细菌制剂优选配制成用于促进植物生长的有机肥料。附图说明图1α一酮丁酸的标准曲线；图2牛血清白蛋白标准曲线。具体实施事例下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明。实施例1土壤微生物zw-26的分离培养1、样品采集：在甘肃省靖远县郊区(36.36N，104.42W)蚕豆植株的田地内，挑选生长旺盛、有大量结瘤的蚕豆植株，根据Riley和Barber的方法采集根瘤周围4mm以内的蚕豆根际土壤。2、土壤氢细菌的富集、分离：准确称量l0g蚕豆根际4mm内周围土壤，加入装有90mL无菌水(含有25-35个玻璃珠)的锥形瓶中，置振荡器上震荡15分钟，得到初始浓度为10-1的稀释液，连续稀释至10-11，将10-1到10-11梯度的稀释液均匀的涂布于矿质盐培养基上，倒置于改良的气体循本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氢氧化细菌zw‑26，其分类命名为假单胞菌属zw‑26（Pseudomonas sp. zw‑26），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2018639。

【技术特征摘要】
1.一种氢氧化细菌zw-26，其分类命名为假单胞菌属zw-26（Pseudomonassp.zw-26），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo：M2018639。2.根据权利要求1所述的氢氧化细菌zw-26，其生态特征为：在矿质盐培养基上可形成菌落，呈乳白色，圆形小菌落；个体形态是球状，革兰氏染色阴性。3.权利要求1所述的氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤如下：(1)样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；(2)土壤富集：将采集的土壤样品置于持续通H2的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；(3)菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；(4)菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。4.根据权利要求3所述的氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤，其特征在于：其中步骤(1)所述的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草，根际土壤范围为距离根瘤5mm以内。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卫卫，李璐璐，刘瑞瑞，李志英，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61