一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂制造技术

本发明专利技术涉及一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂，属于农业微生物技术领域。为解决大豆根瘤菌结瘤率低、固氮效果差的问题，本发明专利技术提供了一株日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25，保藏编号为CGMCC No.14857，该菌株具有较强的匹配亲和性、结瘤竞争力，结瘤及固氮能力。本发明专利技术还提供了一种复合根瘤菌剂，由日本慢生根瘤菌HF25和产酸克雷伯氏菌ASP‑15制成，两种菌复配显著提高了HF25根瘤菌的结瘤及固氮能力，将其应用于大豆种植，与未施菌剂的对照相比大豆结瘤数提高了170％，单株豆荚数增加了37.3％，大豆百粒重提高了5.5％。

A Soybean Slow-growing Rhizobium with Broad-spectrum Nodulation Characteristics and Its Application and Compound Rhizobium Agent

The invention relates to a soybean slow-growing Rhizobium with broad-spectrum nodulation characteristics and its application and a compound Rhizobium agent prepared by the soybean slow-growing rhizobium, belonging to the technical field of agricultural microorganisms. In order to solve the problems of low nodulation rate and poor nitrogen fixation effect of soybean rhizobium, the invention provides a Japanese slow-growing Rhizobium HF25 with a storage number of CGMCC No. 14857, which has strong matching affinity, nodulation competitiveness, nodulation and nitrogen fixation ability. The invention also provides a compound Rhizobium agent, which is made of Japanese slow-growing Rhizobium HF25 and Klebsiella acidogenicus ASP 15. The combination of the two bacteria significantly improves the nodulation and nitrogen-fixing ability of HF25 Rhizobium and applies it to soybean cultivation. Compared with the control without inoculant, the nodulation number of soybean is increased by 170%, the pod number per plant is increased by 37.3%, and the 100-seed weight of soybean is increased by 5%.

【技术实现步骤摘要】
一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂
本专利技术属于农业微生物
，尤其涉及一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂。
技术介绍
大豆是重要的粮食作物和油料作物，其对氮素的吸收量较高，生产100kg大豆约吸收6.5～8.5kg氮素。人工接种根瘤菌是增强大豆结瘤固氮能力，增加氮素营养，提高大豆产量的有效措施。目前国际上，如美国、巴西和阿根廷等大豆出口大国，大豆氮肥主要依靠接种大豆根瘤菌形成根瘤来提供，30％～65％以上种植面积，甚至达到100％的种植面积仅接种大豆根瘤菌进行生物固氮即可满足作物对氮素的需求，其单位面积产量是中国大豆产量的1.4～1.5倍。而在我国，接种大豆根瘤菌的种植面积仅占全部种植面积的3％左右，根瘤菌的应用水平相差甚远。多年来，我国大豆的生产还主要依赖于化肥，截止到目前，全国正式登记的微生物肥料产品有5千多个，而与大豆根瘤菌有关的产品不到20个，以大豆主产区的黑龙江省为例，仅有3家正式登记的与大豆根瘤菌有关的产品，根瘤菌应用面积不足大豆总种植面积的10％。缺乏高效的根瘤菌是造成根瘤菌应用水平较低的主要原因，制约着我国大豆产业的发展。土壤中固氮效率低的土著根瘤菌与大豆品种具有较强的匹配亲和性，从而大大降低了高效固氮根瘤菌接种剂的作用效果。为了提高大豆根瘤菌的结瘤率和固氮效果，必须筛选出结瘤竞争性能和固氮性能优良的广谱性根瘤菌株。
技术实现思路
为解决大豆根瘤菌结瘤率低、固氮效果差的问题，本专利技术提供了一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂。本专利技术的技术方案：本专利技术提供了一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌，其为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年11月3日，保藏编号为CGMCCNo.14857。本专利技术提供的一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌在大豆种植中的应用。进一步的，是将所述日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25发酵培养后的菌液与大豆种子混拌均匀，阴干后播种。进一步的，所述日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25发酵培养后的菌液所含活菌数为2.3～3.8×1010cfu/mL。本专利技术还提供了一种复合根瘤菌剂，包括日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)ASP-15。进一步的，所述产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)ASP-15，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月17日，保藏编号为CGMCCNo.4488。进一步的，其为液体复合根瘤菌剂，包括日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25发酵培养后的菌液和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)ASP-15发酵培养后的菌液。进一步的，所述液体复合根瘤菌剂中含有日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25的活菌数为2.3～3.8×1010cfu/mL，含有产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)ASP-15的活菌数为1.2～2.1×1010cfu/mL。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25具有广谱结瘤特性，与多种大豆品种匹配亲和性好，结瘤能力强，具有较强的结瘤竞争能力和固氮能力；将其应用于大豆种植，能将大豆百粒重提高3％，单株豆荚数增加25％。本专利技术提供的复合根瘤菌剂将日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)ASP-15相复配，进一步提高了日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25的结瘤和固氮能力，将复合根瘤菌剂应用于大豆种植，与不施肥对照相比大豆的结瘤率提高了170％，大豆百粒重提高5.5％，单株豆荚数增加了37.3％，进一步提高了大豆的产量和品质。附图说明图1为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25的显微形态照片；图2为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25的菌落形态照片；图3为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25的生长曲线。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。实施例1从黑龙江林口大豆种植田采集生长期的大豆，从大豆根部的根瘤中获得一株大豆根瘤菌，将其编号为HF25。参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对该菌株进行形态特性、生理生化特性及分子生物学鉴定，结果如下：(1)形态学特性：在显微镜下观察，HF25根瘤菌属于革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，无芽孢，菌体细长，菌体大小为0.5～0.9μ×1.2～3.0μ，其微观形态见图1；HF25根瘤菌在甘露醇培养基上生长缓慢，菌落呈白色突起、圆形、菌落表面闪光、不透明、奶油状、有少量胶质形成，其菌落形态见图2。(2)生理生化特性：HF25根瘤菌在含有0.5％溴麝香草酚兰的YMA培养基中呈蓝色，在含有0.5％刚果红的YMA培养基上呈红色，在肉汤蛋白胨的培养基中不生长，在马铃薯块上不生长，以单鞭毛运动，好氧，最适PH范围为6.0～8.0，最适生长温度范围为25℃～30℃。(3)16SrDNA序列测定及系统进化分析：用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGENBIOTECH)提取HF25根瘤菌的基因组DNA为模板，采用通用引物进行16SrDNAPCR扩增，利用胶回收试剂盒将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶进行胶回收，将PCR回收后产物交由CICC进行测序，得到HF25根瘤菌的16SrDNA的核苷酸序列；对HF25根瘤菌的16SrDNA核苷酸序列进行鉴定，将其提交到NCBI的GenBanK数据库中进行比对分析，并与已报道的序列进行同源性比对，比对结果为HF25与Bradyrhizobiumjaponicum的同源性达到了99％以上。通过形态观察、生理生化特性鉴定和16SrDNA序列分析，将菌株HF25鉴定为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)，并于2017年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.14857。实施例2本实施例测定了培养基pH值对HF25根瘤菌生长的影响：采用无菌操作，用接种环挑取1环HF25根瘤菌斜面培养物接种于含100mlYM液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于30℃，转速150r/min的条件下，振荡培养48小时，获得种子液。将装有5mLYM培养基的试管中的培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌，其特征在于，其为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年11月3日，保藏编号为CGMCC No.14857。

【技术特征摘要】
1.一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌，其特征在于，其为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年11月3日，保藏编号为CGMCCNo.14857。2.如权利要求1所述一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌在大豆种植中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，是将所述日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25发酵培养后的菌液与大豆种子混拌均匀，阴干后播种。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25发酵培养后的菌液所含活菌数为2.3～3.8×1010cfu/mL。5.一种复合根瘤菌剂，其特征在于，包括日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25和产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxy...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛彦波，吴晧琼，安琦，殷博，曹亚彬，王笑庸，原韬，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23