本发明专利技术涉及一组用于检测猪圆环病毒1型和猪圆环病毒3型的实时荧光定量PCR‑HRM引物，属于动物传染病学领域。该引物根据PCV1和PCV3基因组在复制相关蛋白（Rep）的核苷酸序列特征性差异设计，该差异区PCV1和PCV3存在明显的特征性核苷酸序列差异（GC%含量存在差异），导致PCV1和PCV3在该区域存在熔解温度（Tm）峰值差异，经过建立的实时荧光定量PCR方法扩增后，会出现不同的Tm峰值进行PCV1和PCV3的区分。本发明专利技术仅需一组引物即可对PCV1和PCV3进行鉴别诊断，同时还可特异性的明确猪只感染PCV1和PCV3的感染程度。本发明专利技术使用方法简单有效，成本低廉，准确性高。
Real-time fluorescent quantitative PCR-HRM primers for detection of PCV1 and PCV3
The invention relates to a set of real-time fluorescence quantitative PCR HRM primers for detecting porcine circovirus type 1 and porcine circovirus type 3, and belongs to the field of animal infectious diseases. The primers were designed according to the difference of nucleotide sequence characteristics between PCV1 and PCV3 genomes in replication-related protein (Rep). PCV1 and PCV3 had obvious difference in characteristic nucleotide sequence (GC% content difference), which led to the difference of peak melting temperature (Tm) between PCV1 and PCV3 in this region. After amplification by real-time fluorescence quantitative PCR, different Tm appeared. The peak values were differentiated between PCV1 and PCV3. The invention can differentiate PCV1 and PCV3 by only one set of primers, and at the same time can specify the infection degree of PCV1 and PCV3 in pigs. The invention has simple and effective use method, low cost and high accuracy.
【技术实现步骤摘要】
用于检测PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物
本专利技术涉及一组用于检测猪圆环病毒1型和猪圆环病毒3型(porcinecircovirustype1andtype3，PCV1和PCV3)的实时荧光定量PCR-HRM引物，属于动物传染病学领域。
技术介绍
高分辨率熔解曲线（HighResolutionMelt，HRM）是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。当使用SYBRGreenI为荧光染料时，在实时荧光PCR扩增结束后通常要运行一步熔解曲线反应程序。即将PCR产物的温度由低到高逐步升高，在升温的过程中，双链DNA解链成单链DNA分子，原先与双链结合的荧光染料分子就与DNA脱离，而不再产生荧光信号。因此，随着温度的升高，样品的荧光信号由强转弱，从而形成一个荧光信号随温度升高而减弱的熔解曲线图，再以荧光值随温度的变化率为纵坐标作图，就形成荧光变化率随温度变化的峰形图，每一个样品在该图上呈现为一个峰形曲线。这个峰值所对应的特定温度我们就称之为该样品的熔解温度Tm，在该温度下50%的双链已解链变为单链，该温度和扩增区域的GC%含量存明显的正相关关系。猪圆环病毒（Porcinecircovirus,PCV）是迄今发现的最小的动物病毒之一，当前猪圆环病毒有3种：PCV1、PCV2和PCV3。PCV1为非致病性的病毒；PCV2为致病性的病毒；PCV3的有无致病力好需要更进一步深入明确。对PCV1和PCV2的基因组进行分析发现，PCV1基因组全长1759bp，PCV2全长1768bp（或1767bp），二者序列同源性小于80%，但PCV-1毒株间的核酸序列同源性大于99%，PCV-2毒株间的核序列同源性大于96%。ORF1是PCV1和PCV2最大的阅读框，位于病毒基因组的5’端，编码病毒的复制蛋白（Rep），分子量大小为37KDa，与病毒的复制转录有关。2016年，美国堪萨斯州立大学科研人员利用宏基因组测序技术，从患有皮炎肾病综合征（PDNS）和繁殖障碍母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3型（Porcinecircovirus3，PCV3）。作为一种新发现病原体，PCV3对猪致病性及在猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）中作用以及现有商品化PCV2疫苗对其免疫效力等有待进一步研究。和PCV1、PCV2一样，PCV3病毒颗粒直径为17-20nm，核酸类型为单股DNA病毒，基因组长度为2000bp，包含有与复制相关的复制蛋白rep和与抗原相关的抗原蛋白cap。本专利技术的目的是提供一种PCV1和PCV3的鉴别诊断方法。一般而言，对2种或以上的病原进行实时荧光定量PCR需要分别设计引物，进行分别扩增，再组装成多重试剂盒。即一般需要设计4条引物，才可以对猪圆环病毒2种基因型（PCV1和PCV3）进行扩增。但是4条引物在条件优化上均为繁琐复杂，且引物越多可能导致的潜在交叉可能性越大，较难达到相关研究目的。本专利技术最大的优点是基于PCV1和PCV3的基因组结构特点，选择PCV1和PCV3的复制相关蛋白编码区核苷酸特异性差异区设计引物（一组引物），该引物针对的区域需要同时对PCV1和PCV3均可进行实时荧光定量PCR，且该扩增区域存在核苷酸特征的GC含量差异，导致实时荧光定量结果的溶解曲线Tm值存在差异，即可对PCV1和PCV3进行鉴别诊断。本专利技术的建立可填补国内外相关领域空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于检测PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物。为实现上述目的，采用以下技术方案：用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物，所述引物其核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’-GTGGTGGGATGGDTATMATGG-3’，下游引物P2：5’-CCASCCATAAAAATCATCCA-3’。所述的引物用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物，包含以下步骤：（1）从疑似临床样品中提取基因组DNA；（2）以提取的DNA为模板，用所述的引物P1和P2进行实时荧光定量PCR扩增；（3）利用高分辨率熔解曲线方法导致的PCV1和PCV3熔解温度值差异，对PCV1和PCV3进行鉴别诊断。所述的PCR-HRM引物在制备鉴别诊断PCV1和PCV3试剂盒上的应用。本专利技术的优点在于：本专利技术是基于PCV1和PCV3的基因组结构特点，选择PCV1和PCV3的复制相关蛋白编码区核苷酸特异性差异区设计引物（一组引物），该引物针对的区域需要同时对PCV1和PCV3均可进行实时荧光定量PCR，且该扩增区域存在核苷酸特征的GC含量差异，导致实时荧光定量结果的溶解曲线Tm值存在差异，即可对PCV1和PCV3进行鉴别诊断。本专利技术的建立可填补国内外相关领域空白。附图说明图1PCV1和PCV3核苷酸同源性比较。图2PCV1和PCV3核苷酸分析。图3熔解曲线分析。图4扩增曲线特异性分析。具体实施方式下面实施例对本专利技术做进一步的描述。实施例11、毒株：猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒3（PCV3）、猪细小病毒（PPV）、经典猪伪狂犬病毒（PRV）、变异型猪伪狂犬病毒（V-PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。2、引物设计与合成2.1PCV1和PCV3基因组序列比对选择PCV1代表株（PK株，GenBank登陆号DG650650；BJ-1株，GenBank登陆号FJ475129）PCV3代表株（CN2018LN-2株，GenBank登陆号MH277116；CN2018LN-3株，GenBank登陆号MH277117）为例，选择DNAStar生物学软件进行核苷酸同源性比较，结果可见：PCV1相互之间的核苷酸同源性在99.7%以上，PCV3相互之间的核苷酸同源性在99.5%以上，PCV1和PCV2相互之间的核苷酸同源性在48.7%-48.9%之间（图1），表明PCV1和PCV3核苷酸差异较大。经核苷酸同源性比对发现（图2），PCV1和PCV3在基因组的5复制相关蛋白（Rep）存在特征性核苷酸差异（见图中方框中间的区域），但是在差异区的前后均存在PCV1和PCV3特异性的保守区（见图中方框）。2.2引物设计基于PCV1和PCV3基因组序列比对的分析结果，在PCV1和PCV3特异性的保守区——前端保守区设计特异性的上游引物P1（图2——上游），在保守区——后端保守区设计特异性的下游引物P2（图2——下游），该引物就可以同时对PCV1和PCV3进行扩增。其中引物P1和P2序列为：上游引物P1：5’-GTGGTGGGATGGDTATMATGG-3’，下游引物P2：5’-CCASCCATAAAAATCATCCA-3’。3、实时荧光定量PCR扩增以常规方法提取PCV1和PCV3的基因组DNA。用所设计的特异性实时荧光定量PCR引物P1和P2进行实时荧光定量PCR扩增。优化出的25μL最佳反应体系为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR‑HRM引物，其特征在于：所述引物其核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’‑ GTGGTGGGATGGDTATMATGG ‑3’，下游引物P2：5’‑ CCASCCATAAAAATCATCCA ‑3’。
【技术特征摘要】
1.用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物，其特征在于：所述引物其核苷酸序列如下所示：上游引物P1：5’-GTGGTGGGATGGDTATMATGG-3’，下游引物P2：5’-CCASCCATAAAAATCATCCA-3’。2.如权利要求1所述的引物用于检测鉴别PCV1和PCV3的实时荧光定量PCR-HRM引物，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈如敬，陈秋勇，吴学敏，车勇良，王晨燕，周伦江，侯博，严山，王隆柏，魏宏，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35
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