本发明专利技术公开了一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物及试剂盒与检测方法，其中所述RPA检测的引物是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对，用于检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒。以该引物对克氏原螯虾待测样本进行检测，若RPA扩增产物含有大小为151bp的片段，则所述待测克氏原螯虾中含有小RNA病毒。检测方法包括引物合成、待测样品中RNA的提取、反转录、RPA扩增及扩增产物分析等步骤，该检测方法操作简单，稳定性好，为有效检测和鉴定克氏原螯虾小RNA病毒提供一种成本低、快速、特异的现场诊断方法。
A Primer, Kit and Detection Method for Detecting Small RNA Virus in Crayfish by RPA
The invention discloses a primer and a kit and a detection method for detecting prokaryotic crayfish small RNA virus by RPA. The primer pairs of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2 are used for detecting or assisting the detection of prokaryotic crayfish small RNA virus. The primer was used to detect the samples of crayfish. If the amplified product of RPA contained a 151 BP fragment, the tested crayfish contained small RNA virus. The detection method includes primer synthesis, RNA extraction from samples to be tested, reverse transcription, RPA amplification and analysis of amplified products. The method is simple and stable. It provides a low-cost, rapid and specific field diagnosis method for the effective detection and identification of prokaryotic crayfish small RNA virus.
【技术实现步骤摘要】
一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物及试剂盒与检测方法
本专利技术属于水产动物病毒的分子检测
，涉及到一种利用重组酶介导等温扩增技术检测克氏原螯虾小RNA病毒的方法以及检测专用引物。
技术介绍
克氏原螯虾(Procambarusclarkii)，俗称小龙虾，隶属于节肢动物门、甲壳纲、原螯虾属。原产于美国南部和墨西哥北部，后由日本引进入中国。由于其较高的营养价值及其独特的风味，目前已成为一种重要淡水经济水生动物，是我国水产增养殖的重要对象。然而近年来，随着克氏原螯虾人工养殖面积的不断扩大，克氏原螯虾病害频发，导致产量降低，品质下滑，农户受损严重，其中，以克氏原螯虾“五月瘟”，或称“五月魔咒”，最为严重。目前，有关克氏原螯虾“五月瘟”病原的研究报道并不多，一般认为白斑综合征病毒（WSSV）是引起“五月瘟”的主要病原。在对克氏原螯虾“五月瘟”病原研究过程中，我们新发现了一种小RNA病毒，此病毒与“五月瘟”密切相关，可能是导致克氏原螯虾“五月瘟”的另一重要病原。小RNA病毒（Picornaviridae）为22～30纳米的二十面体，无包膜，基因组为连续线型单链RNA。大多数已知的小RNA病毒常感染哺乳动物和鸟类，但也有一些在两栖动物、节肢动物和水产鱼类中检测到。感染此病毒可引起中枢神经系统、心脏、肝脏、皮肤、胃肠道或上呼吸道疾病。目前，虾蟹病毒病尚无有效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一种简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。目前应用较多病毒检测方法有聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。但这些方法均需要昂贵的PCR仪或特殊仪器设备和专业的试验场地，同时PCR扩增的过程，需要有特殊的热循环设备、低温保存的试剂和避免交叉污染的技术操作要求,且操作复杂繁琐、耗时长，时效性低，同时也需要具有一定分子生物学基础及操作技术诊断的需求限制了PCR在现场诊断中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物及试剂盒与检测方法，以建立克氏原螯虾小RNA病毒的快速检测方法。本专利技术的技术方案如下：本专利技术首先针对克氏原螯虾小RNA病毒的基因保守区域提供了一对用于RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物：RPAPcPV-1F:5’-CTGATGAGGAATTAGACGATCTTATCGTTG-3'；（SEQIDNO.1）RPAPcPV-1R:5’-CAGAATTAAAGACCGACGTTAGTAGATGAC-3'。（SEQIDNO.2）本专利技术又提供了一种利用RPA检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒的试剂盒，该试剂盒包括以上SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物。进一步地，该试剂盒还可以包括RehydrationBuffer，ddH2O和醋酸镁溶液。其中所述醋酸镁溶液的浓度可以为280mM。本专利技术又提供了一种基于上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：步骤一，从待测克氏原螯虾上提取病毒RNA，并反转录成cDNA备用；步骤二，以步骤一得到的cDNA为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为引物进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小；步骤三，对检测结果进行判定，如RPA扩增产物含有大小为151bp的片段，则所述待测克氏原螯虾中含有小RNA病毒，反之则不含有小RNA病毒。进一步地，步骤二中RPA扩增可以包括以下步骤：步骤1，配制47.8μl的混合反应液，包括29.5μlRehydrationBuffer,10μM的上游引物2.4μl，10μM的下游引物2.4μl，模板cDNA1μl和ddH2O12.5μl；步骤2，将混合反应液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280mM醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，37℃反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应30min。本专利技术提供的SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物以及试剂盒在检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下的有益效果：1、本专利技术所设计的RPA检测专用引物对长度在30-35bp，比一般的PCR检测引物长。引物过短会降低重组率，影响RPA反应的扩增速度和检测灵敏度。2、本专利技术提供了一组使用于克氏原螯虾小RNA病毒RPA检测的引物对，将该引物对应用于河蟹布尼亚病毒的RPA检测中，具有简单便捷，快速检测，特异性强，灵敏度高等优点。3、本专利技术检测方法无需对病毒进行分离纯化及培养，反应在37℃左右的恒温条件下即可实现模板核酸的扩增，也不需要通过高低温循坏实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备，非常适合基层对病原菌的快速检测需要。4、本专利技术用于克氏原螯虾组织中小RNA病毒的快速检测，只需约2.5h即可完成从病毒提取到获得检测结果的所有过程，是一种用于检测克氏原螯虾感染小RNA病毒的有效手段。5、本专利技术检测方法用于克氏原螯虾“五月瘟”发病前期检测及病害预测预防，对于确定防治期、有效防治病害具有非常重要的意义。附图说明图1是RPA引物扩增凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker500，1为引物RPAPC-PV-1R-1F，2为阴性对照，3为控制对照。图2是不同RPA反应温度下的凝胶电泳图。其中，泳道为Marker500、1为35℃、2为37℃、3为39℃、4为41℃。图3是不同RPA反应时间下的凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker500、1为10min、2为20min、3为30min、4为40min、5为50min。图4是RPA与PCR反应灵敏度检测凝胶电泳图。其中，A为RPA反应、B为PCR反应；泳道为Marker500、1为1400pg/μL、2为100pg/μL、3为10pg/μL、4为1pg/μL、5为100fg/μL。图5是RPA检测特异性凝胶电泳图。其中，M为Marker500、1为克氏原螯虾小RNA病毒（PcPV）、2为河蟹呼肠孤病毒（EsRV）、3为河蟹呼肠孤-816病毒（EsRV-816）、4为河蟹呼肠孤-905病毒（EsRV-905）、5为河蟹诺达病毒（EsNV）、6为对虾白斑病毒（WSSV）、7为阴性对照。具体实施方式：下列实施例仅为本专利技术的优选技术方案，并不用于对本专利技术进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本专利技术可以有各种更改和变化。凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。若未特别指明，以下实施例均照常规实验条件进行操作，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中使用RPA试剂盒为Basic试剂盒，购自英国TwistDxInc公司；其中，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶是以冻干粉状态存在于试剂盒所提供的RPA反应管中，使用时直接用试剂盒所带的反应缓冲液稀释。整个RPA反应是在RPA反应管中进行。实施例1根据克氏原螯虾小RNA病毒的序列，设计了SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示核苷酸序列的由上下游引物组成的RPA引物对。上游引物R本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物，其特征在于，包括SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种利用RPA检测克氏原螯虾小RNA病毒的引物，其特征在于，包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的引物对在检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒中的应用。3.一种利用RPA检测或辅助检测克氏原螯虾小RNA病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的引物对。4.根据权利要3所述的试剂盒，其特征在于，还包括RehydrationBuffer，ddH2O和醋酸镁溶液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述醋酸镁溶液的浓度为280mM。6.权利要求4所述的试剂盒检测克氏原螯虾小RNA病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，从待测克氏原螯虾上提取病毒RNA，并反转录成cDNA备用；步骤二，以步骤一得到的cDNA为模板，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2为引物进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈怀舜，臧亚南，胡亚成，徐增洪，水燕，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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