一种水中诺如病毒的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种水中诺如病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)水样处理与诺如病毒的富集；(2)诺如病毒RNA的提取，得到纯化的病毒核酸溶液；(3)配置RT‑PCR反应液；(4)荧光定量PCR仪检测；所述荧光定量PCR仪检测的程序为：50℃30min；95℃5min；95℃15s、60℃30s采集信号；65℃30s，循环45次，荧光通道检测选择FAM、VIC通道。本发明专利技术的水中诺如病毒的检测方法，使用荧光定量PCR仪进行检测，灵敏性和准确度较高，并可定量分析。

A Method for Detecting Norovirus in Water

The invention discloses a detection method for Norovirus in water, which comprises the following steps: (1) water sample treatment and enrichment of Norovirus; (2) extraction of Norovirus RNA to obtain purified viral nucleic acid solution; (3) configuration of RT PCR reaction solution; (4) detection by fluorescent quantitative PCR instrument; the detection procedure of the fluorescent quantitative PCR instrument is: 50 30 minutes; 95 5 minutes; 95 15 s; 60 30 s to collect signals. FAM and VIC channels were selected for fluorescence channel detection. The detection method of Norovirus in water of the invention can be detected by fluorescent quantitative PCR instrument, with high sensitivity and accuracy, and can be quantitatively analyzed.

【技术实现步骤摘要】
一种水中诺如病毒的检测方法
本专利技术涉及水中病毒的检测方法，特别涉及一种水中诺如病毒的检测方法。
技术介绍
诺如病毒属于人类杯状病毒科，诺如病毒属，诺如病毒基因组是单股正链RNA，基因组全长约7kb～7.5kb。诺如病毒共可分为GⅠ～GⅤ5个基因型，其中感染人的主要是GⅠ型和GⅡ型。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90％是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。目前，国内针对水中诺如病毒的检测报道较少，诺如病毒在水中虽然比较稳定但无法增值，导致难以检测，所以，开发一种准确、稳定的检测水样品中诺如病毒的方法尤为重要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种水中诺如病毒的检测方法，该方法可以对水中的诺如病毒进行准确、定量的检测。为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下的技术方案：一种水中诺如病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)水样处理与诺如病毒的富集；(2)诺如病毒RNA的提取，得到纯化的病毒核酸溶液；(3)配置RT-PCR反应液；(4)荧光定量PCR仪检测；所述荧光定量PCR仪检测的程序为：50℃30min；95℃5min；95℃15s、60℃30s采集信号；65℃30s，循环45次；荧光通道检测选择FAM、VIC通道。进一步地，所述水样处理与诺如病毒的富集的步骤为：取水样，加入MgCl2溶液使其浓度达到0.03～0.05mol/L，调节水样使pH至3.0～5.0，使水样通过混合硝酸纤维素膜，用牛肉膏-甘氨酸洗脱液震荡洗脱滤膜；去除滤膜，调节洗脱液pH至6.0～8.0，向洗脱液中加入PEG8000溶液放置过夜，离心保留沉淀；加入无RNA酶的超纯水溶解沉淀，离心后上清液为病毒粗提取物。进一步地，所述诺如病毒RNA的提取步骤为：取病毒粗提取物，加入裂解液，充分混匀，然后漂洗液漂洗数次，加入洗脱液，离心后得到纯化的病毒核酸溶液。进一步地，所述MgCl2溶液的浓度为2.5mol/L。进一步地，所述牛肉膏-甘氨酸洗脱液的配置方法为：将30.0g牛肉膏和3.75g甘氨酸搅拌溶解于超纯水中，调节pH至9.5，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min。进一步地，所述水样处理与诺如病毒的富集的步骤中，洗脱液与PEG8000溶液的体积比为1:0.25。进一步地，所述PEG8000溶液的配置方法为：将PEG8000400.0g和氯化钠87.0g搅拌溶解于超纯水中，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min。进一步地，所述病毒粗提取物加入裂解液的体积为600μL。与现有技术相比，本专利技术的水中诺如病毒的检测方法的有益效果为：本专利技术的水中诺如病毒的检测方法，使用荧光定量PCR仪进行检测，灵敏性和准确度较高，并可定量分析。附图说明下面结合附图中的具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。图1为本专利技术实施例中病毒提取过程控制的RNA标准曲线图。具体实施方式实施例1水中诺如病毒的检测方法，包括以下步骤：(1)水样处理与诺如病毒的富集取水样，加入2.5mol/LMgCl2溶液使其浓度达到0.03～0.05mol/L，用1mol/L盐酸调节水样使pH至3.0～5.0，采用真空抽滤使之通过孔径为0.22μm的混合硝酸纤维素膜，然后用10mL牛肉膏-甘氨酸洗脱液震荡洗脱滤膜20～30min；去除滤膜，用1mol/L盐酸调节洗脱液pH至6.0～8.0，向洗脱液中加入0.25倍体积的PEG8000溶液，上下颠倒离心管以充分混匀。将离心管及样液一起在4℃放置过夜。然后在4℃下，10000g离心5min，弃去上清，保留沉淀。然后加入200μL无RNA酶的超纯水，60℃加热5min充分溶解沉淀。4℃，10000g离心3min，取上清，得到病毒粗提产物。另取一水样加入10μL过程控制病毒，摇匀，同法操作，作为过程控制1。(2)诺如病毒RNA的提取：按照病毒核酸提取试剂盒(购自江苏硕世生物科技有限公司)说明:取200μL含有病毒的液体，加入600μL裂解液，充分混匀，室温放置5分钟，期间颠倒管子数次帮助裂解。加入600μL缓冲液到裂解好的样本溶液中，充分混匀。转移650μL混合液到套有接液管的亲和柱内，13000rpm离心30秒，弃掉过滤液，重复此操作直到滤完剩下的液体。加入500μL漂洗液到亲和柱内，13000rpm离心30秒，弃掉过滤液，重复此步骤一次。将亲和柱重新套入到RNase-free的离心管中，向亲和柱底部吸附膜的中心部位加入50μL洗脱液，室温放置2分钟，13000rpm离心2分钟收获纯化的病毒核酸溶液。(3)配置RT-PCR反应液按照诺如病毒(GI/GII)核酸检测试剂盒(RT-PCR探针法)说明操作配制诺如病毒GI/GII反应体系。按照MS2过程控制试剂盒(RT-PCR探针法)说明操作配制MS2反应体系。另取20μLMS2过程控制，于95℃加热5min后在冰上冷却至室温，按照1:9的比例进行梯度稀释，用于制作过程控制标准曲线。其中，诺如病毒(GI/GII)核酸检测试剂盒购自江苏硕世生物科技有限公司，MS2过程控制试剂盒购自北京良润生物科技有限公司。按照表1的方法设置过程控制与外加扩增控制。根据反应体系、上机样品管数计算各试剂所需用量如表3和表4所示。表1往PCR管中分装反应液，每管20μL；在各管中加入相应的反应模板，反应液与模板混匀，立即进行PCR反应。(4)荧光定量PCR仪检测使用LightCycler96型荧光定量PCR仪进行检测。反应程序为：50℃30min；95℃5min；95℃15s、60℃30s采集信号；65℃30s，循环45次。荧光通道检测选择：FAM、VIC通道。试验例1.溶液的配置(1)PEG8000溶液：将400.0gPEG8000、87.0g氯化钠，搅拌溶解于超纯水中，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min，备用。(2)2.5mol/LMgCl2溶液：将238.0g氯化镁(MgCl2)搅拌溶解于超纯水中，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min，备用。(3)牛肉膏-甘氨酸洗脱液(含3％牛肉膏，0.05mol/L甘氨酸，pH9.5)将30.0g牛肉膏和3.75g甘氨酸搅拌溶解于超纯水中，调节pH至9.5，用超纯水定容至1000mL，分装，121℃高压灭菌15min，备用。2.样品处理和病毒富集取水样两瓶，每瓶500mL，分别加入10mL的2.5mol/LMgCl2溶液，使其浓度达到0.03～0.05mol/L。然后用1mol/L盐酸调节水样使pH至3.0～5.0，其中一瓶加入10μL过程控制病毒，摇匀，作为过程控制1。采用真空抽滤使之通过孔径为0.22μm的混合硝酸纤维素膜，然后用10mL牛肉膏-甘氨酸洗脱液震荡洗脱滤膜20～30min；去除滤膜，用1mol/L盐酸调节洗脱液pH至6.0～8.0，向洗脱液中加入0.25倍体积的PEG8000溶液，上下颠倒离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)水样处理与诺如病毒的富集；(2)诺如病毒RNA的提取，得到纯化的病毒核酸溶液；(3)配置RT‑PCR反应液；(4)荧光定量PCR仪检测；所述荧光定量PCR仪检测的程序为：50℃ 30min；95℃ 5min；95℃ 15s、60℃ 30s采集信号；65℃ 30s，循环45次；荧光通道检测选择FAM、VIC通道。

【技术特征摘要】
1.一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)水样处理与诺如病毒的富集；(2)诺如病毒RNA的提取，得到纯化的病毒核酸溶液；(3)配置RT-PCR反应液；(4)荧光定量PCR仪检测；所述荧光定量PCR仪检测的程序为：50℃30min；95℃5min；95℃15s、60℃30s采集信号；65℃30s，循环45次；荧光通道检测选择FAM、VIC通道。2.根据权利要求1所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述水样处理与诺如病毒的富集的步骤为：取水样，加入MgCl2溶液使其浓度达到0.03～0.05mol/L，调节水样使pH至3.0～5.0，使水样通过混合硝酸纤维素膜，用牛肉膏-甘氨酸洗脱液震荡洗脱滤膜；去除滤膜，调节洗脱液pH至6.0～8.0，向洗脱液中加入PEG8000溶液放置过夜，离心保留沉淀；加入无RNA酶的超纯水溶解沉淀，离心后上清液为病毒粗提取物。3.根据权利要求1所述的一种水中诺如病毒的检测方法，其特征在于，所述诺如病毒RNA的提取步骤为：取病毒粗提取物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗达龙，黄琳，覃蓝，李夷君，
申请(专利权)人：梧州市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：广西,45