一种钩吻中生物碱含量的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种钩吻中生物碱含量的测定方法，属于有机分析领域。其包括以下步骤：取经粉碎的钩吻样品加入盐酸水溶液提取，离心后吸取其上清液至已活化的MCX固相萃取柱中富集目标物，经淋洗、洗脱、吹干、溶解残渣过滤后得到供试品溶液；取生物碱标准品配制成适当标准溶液与供试品溶液上机测定，通过液相色谱仪进行梯度洗脱质谱仪进行测定后利用标准溶液的峰面积与浓度绘制标准曲线，通过标准曲线计算得到钩吻中各生物碱含量。本发明专利技术利用高效液相色谱‑三重四极杆串联质谱法对11种钩吻生物碱进行定性、定量测定。并针对钩吻植株中不同部位的生物碱含量的进行检测，为探究钩吻的安全高效应用和中毒防治提供了数据支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种钩吻中生物碱含量的测定方法
本专利技术涉及有机分析
，具体涉及一种钩吻中生物碱含量的测定方法。
技术介绍
钩吻(Gelsemiumelegans)作为一种中国传统药用植物，属于马钱科、钩吻属，又称为胡蔓藤、野葛，广泛的分布于我国南部至西南地区。目前已经在我国的广东、广西、福建、贵州、云南等9个省份发现或种植。随着科技的发展，人们开始对钩吻的化学成分、化学结构以及药理毒理进行研究，发现钩吻的临床应用相当广泛，其具有抗肿瘤、镇痛镇静、治疗心血管疾病，调节自身免疫力、治疗皮肤病、在畜牧业用于畜生飞禽的繁殖等多种功效。但由于它毒性较大，很大程度上限制了其自身的应用。钩吻治疗剂量与引发钩吻中毒剂量之间的有效量非常接近，从古至今常有因意外服用或用其自杀致死，是世界闻名的剧毒药物之一。通过搜索文献，发现目前文献中主要研究钩吻的化学成分和药理作用，但是对于钩吻在单体化合物水平上的活性和对人体的毒性作用机制的研究相对较少，相关的作用机理仍不明确。尽管有不少关于钩吻植株的生物碱含量测定，但至今未见对钩吻的11个生物碱以及不同部位之间同时进行含量测定的研究。因此，需要一种能够检测钩吻植株中的生物碱含量的方法，为钩吻的防治中毒和药物研究做出数据和理论支撑。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种钩吻中生物碱含量的测定方法。为实现本专利技术的目的，通过以下技术方案予以实现：一种钩吻中生物碱含量的测定方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液制备：取经粉碎的钩吻样品，加入盐酸水溶液，超声提取，离心后吸取其上清液至已活化的MCX固相萃取柱中富集目标物，经淋洗、洗脱、吹干后加入甲醇水溶解残渣，过有机滤膜后得到供试品溶液；(2)标准曲线的绘制：取生物碱标准品用甲醇溶解制成标准溶液；利用标准溶液绘制标准曲线；(3)供试品溶液的测定：吸取所述供试品溶液进行色谱梯度洗脱；然后根据色谱梯度洗脱确定目标物质母离子后进行质谱扫描，得到钩吻中生物碱含量的测定值；所述钩吻样品为钩吻植株的花、叶、根或茎；所述目标物为待测量的生物碱。优选地，在所述步骤(1)中，所述盐酸水溶液的质量浓度为1％的盐酸水溶液，所述钩吻样品和盐酸水溶液的质量比为1:50。优选地，在所述步骤(1)中，所述超声处理为在≥100W，40kHz的条件下至少处理30min；所述离心处理为≥3000r/min的条件下至少处理5min。优选地，在所述步骤(1)中，上清液吸取至MCX固相萃取柱中富集前需要用大于上清液的甲醇和水对MCX固相萃取柱进行活化；并弃去流出液后干燥MCX固相萃取柱。优选地，在所述步骤(1)中，所述洗脱用大于上清液量的5％质量的氨化甲醇洗脱，收集洗脱液并在≥40℃下用惰性气体吹干；然后加入含有甲酸的甲醇水溶液溶解残渣，并过孔径≤0.22μm有机滤膜，得到供试品溶液。优选地，在所述步骤(2)中，生物碱标准品用甲醇的比例溶解制成1mg/ml标准储备液，然后将标准储备液用含有甲酸的甲醇水稀释成4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的标准工作溶液；然后用各生物碱测定所得的峰面积与标准工作溶液的浓度绘制标准曲线。优选地，在所述步骤(3)中，色谱梯度洗脱程序如下：梯度时间为0min，流动相A:流动相B＝85％:15％梯度时间为1.50min，流动相A:流动相B＝55％:45％梯度时间为2.00min，流动相A:流动相B＝10％:90％梯度时间为2.50min，流动相A:流动相B＝0％:100％梯度时间为3.50min，流动相A:流动相B＝0％:100％梯度时间为3.51min，流动相A:流动相B＝85％:15％梯度时间为5.50min，流动相A:流动相B＝85％:15％其中流动相A为0.1％质量的甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速为0.4ml/min；柱温为35℃。优选地，在所述步骤(3)中，质谱扫描的条件为：离子源：ESI源检测方式：多反应离子监测毛细管电压：正离子模式，3500V离子源温度：150℃干燥气流量：15L/min雾化气压力：25Psi鞘气温度：350℃鞘气流量：12L/min鞘气：氮气。优选地，在所述步骤(3)中，所述目标物质母离子分别为：273.1m/z、295.1m/z、307.2m/z、317.2m/z、323.1m/z、327.2m/z、339.2m/z、341.2m/z、353.1m/z、353.2m/z、355.2m/z。优选地，钩吻中生物碱包括：钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素戊、钩吻素己、(Z)-阿枯米定碱、钩吻绿碱、兰金断肠草碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丁、N-甲氧基无水老刺木碱二醇和常绿钩吻碱。本专利技术利用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法(HPLC-MS/MS)对11种钩吻目标物生物碱进行定量、定性测定分析，对钩吻中各生物碱的色谱条件、质谱条件进行了探索确定其最佳工艺参数。本专利技术的11种生物碱仪器精密度的RSD为1.1％～2.6％，重复性RSD在2.1％～3.3％，回收率在93.2％～98.8％之间；其测定方法精密度、重复性、稳定性良好。并针对钩吻植株中不同部位的生物碱含量的进行检测，为探究钩吻的安全高效应用和中毒防治提供参考。附图说明图1为钩吻样品制成的供试品溶液中各生物碱的色谱图；图2-图12分别依次为钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素戊、钩吻素己、(Z)-阿枯米定碱、钩吻绿碱、兰金断肠草碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丁、N-甲氧基无水老刺木碱二醇和常绿钩吻碱的HPLC-MS/MS谱图；图13-图23分别依次为钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素戊、钩吻素己、(Z)-阿枯米定碱、钩吻绿碱、兰金断肠草碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丁、N-甲氧基无水老刺木碱二醇和常绿钩吻碱在3-200ng/ml的标准曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本专利技术的限制。对于本专利技术所属
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本专利技术的保护范围。仪器与试药本专利技术钩吻来源钩吻植株采购广西玉林药材市场，采收日期为2018年9月，经梧州市药品食品检验所鉴定为马钱科胡蔓藤属植物钩吻(GelsemiumelegansBenth)。本专利技术所使用的仪器包括：粉碎机DFT-100、电子天平Quintix224-1CN、涡旋振荡仪、超声仪、离心机L009、MCX固相萃取柱(混合型阳离子交换固相萃取小柱)、氮吹仪；三重四极杆液相质谱联用仪Agilent1290-QQQ6490。本专利技术所使用的试剂如未特别说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种钩吻中生物碱含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)供试品溶液制备：取经粉碎的钩吻样品，加入盐酸水溶液，超声提取，离心后吸取其上清液至已活化的MCX固相萃取柱中富集目标物，经淋洗、洗脱、吹干后加入甲醇水溶解残渣，过有机滤膜后得到供试品溶液；/n(2)标准曲线的绘制：取生物碱标准品用甲醇溶解制成标准溶液；利用标准溶液绘制标准曲线；/n(3)供试品溶液的测定：吸取所述供试品溶液进行色谱梯度洗脱；然后根据色谱梯度洗脱确定目标物质母离子后进行质谱扫描，得到钩吻中生物碱含量的测定值；/n所述钩吻样品为钩吻植株的花、叶、根或茎；所述目标物为待测量的生物碱。/n

【技术特征摘要】
1.一种钩吻中生物碱含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)供试品溶液制备：取经粉碎的钩吻样品，加入盐酸水溶液，超声提取，离心后吸取其上清液至已活化的MCX固相萃取柱中富集目标物，经淋洗、洗脱、吹干后加入甲醇水溶解残渣，过有机滤膜后得到供试品溶液；
(2)标准曲线的绘制：取生物碱标准品用甲醇溶解制成标准溶液；利用标准溶液绘制标准曲线；
(3)供试品溶液的测定：吸取所述供试品溶液进行色谱梯度洗脱；然后根据色谱梯度洗脱确定目标物质母离子后进行质谱扫描，得到钩吻中生物碱含量的测定值；
所述钩吻样品为钩吻植株的花、叶、根或茎；所述目标物为待测量的生物碱。


2.根据权利要求1所述的钩吻中生物碱含量的测定方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述盐酸水溶液的质量浓度为1％的盐酸水溶液，所述钩吻样品和盐酸水溶液的质量比为1:50。


3.根据权利要求1所述的钩吻中生物碱含量的测定方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述超声处理为在≥100W，40kHz的条件下至少处理30min；所述离心处理为≥3000r/min的条件下至少处理5min。


4.根据权利要求1所述的钩吻中生物碱含量的测定方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，上清液吸取至MCX固相萃取柱中富集前需要用大于上清液的甲醇和水对MCX固相萃取柱进行活化；并弃去流出液后干燥MCX固相萃取柱。


5.根据权利要求1所述的钩吻中生物碱含量的测定方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述洗脱用大于上清液量的5％质量的氨化甲醇洗脱，收集洗脱液并在≥40℃下用惰性气体吹干；然后加入含有甲酸的甲醇水溶液溶解残渣，并过孔径≤0.22μm有机滤膜，得到供试品溶液。


6.根据权利要求1所述的钩吻中生物碱含量的测定方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，生物碱标准品用甲醇的比例溶解制成1mg/ml标准储备液，然后将标准储备液用含有甲酸的甲醇水稀释成4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、100...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗达龙，王华，覃蓝，陈超杰，黄琳，
申请(专利权)人：梧州市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：广西;45