一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶突变体及在转化L‑天冬氨酸生产β‑丙氨酸中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第98位、305位、451位、111位、139位、403位、469位、372位、325位进行单突变或多突变获得的。本发明专利技术通过比较突变体酶PanD

A mutant of L-aspartate-alpha-decarboxylase and its application

The present invention discloses a mutant of L aspartic acid alpha decarboxylase and its application in transforming L aspartic acid to produce beta alanine. The mutant is obtained by single or multiple mutagenesis of 98, 305, 451, 111, 139, 403, 469, 372 and 325 amino acid sequences shown in SEQ ID NO.1. The invention compares mutant enzyme PanD.

【技术实现步骤摘要】
一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用(一)
本专利技术涉及一种机突变获得的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用，属于基因工程
(二)
技术介绍
β-丙氨酸是自然界中天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，又被称作为β-氨基丙酸或者3-氨基丙酸。β-氨基酸是一种潜在的功能性氨基酸。在工业上，β-氨基酸作为一种非常重要的前体物质，在医药、保健品、化工产品、食品及饲料等方面均有广泛应用。在医药方面，β-丙氨酸广泛应用于合成泛酸和泛酸钙，也是合成肌肽的主要前体物质。β-丙氨酸还可用于合成帕米磷酸二钠，用于缓解肿瘤肿瘤性骨痛和治疗高血钙症，以及用于合成巴柳氮治疗结肠炎和直肠炎。在化工产品方面，在食品和饲料方面，β-丙氨酸可作为调味剂，运动营养补充剂，还能提高动物肉制品质，满足市场对瘦肉的需求。在化工产品方面，β-丙氨酸可用于合成沉淀剂，制备电镀缓蚀剂和铅中毒解毒剂。目前国内外产β-丙氨酸主要是化学合成法与生物法。化学合成主要是丙烯腈法、丙烯酸法以及琥珀酰亚胺降解法。化学法虽然反应效率高，生产速率快，但是需要强酸强碱以及高温高压的条件，污染环境。且副反应复杂，对后期纯化也有一定的影响。生物法合成β-丙氨酸主要有酶法和代谢法。酶法有有机腈降解酶催化β-氨基丙腈和L-天冬氨酸-α-脱羧酶作用下合成丙氨酸。以L-天冬氨酸为底物，在和L-天冬氨酸-α-脱羧酶作用下，脱去α位羧基生成β-丙氨酸，目前也被广泛运用与工业合成β-丙氨酸。目前L-天冬氨酸-α-脱羧酶的研究越来越多，大部分的研究主要集中到Escherichiacoli、Corynebacteriumglutamicum、Bacillussubtilis、Mycobacteriumtuberculosis等微生物。高丽娟等将大肠杆菌panD基因转至BL21(DE3)中进行高效表达，研究酶转化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸的催化能力，每升发酵液酶活达到225U。石增秀等将谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，重组酶比酶活达到156mmol·g-1·h-1。本专利技术旨在对Triboliumcastaneum来源的L-天冬氨酸α脱羧酶进行随机突变，提高酶活、产量及催化稳定性，提高其工业应用价值和生产效率。(三)
技术实现思路
本专利技术提供了一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其在偏中性条件下，生物合成β-丙氨酸的酶活有明显的提高。本专利技术采用的技术方案：本专利技术提供一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，所述突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第98位、305位、451位、111位、139位、403位、469位、372位、325位进行单突变或多突变获得的。进一步，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为下列之一：(1)SEQIDNO.1所示氨基酸第469位的丝氨酸突变为脯氨酸(PanDS469P)；(2)SEQIDNO.1所示氨基酸第111位的脯氨酸突变为丝氨酸(PanDP111S)；(3)SEQIDNO.1所示氨基酸第139位的谷氨酰胺突变为脯氨酸(PanDQ139P)；(4)SEQIDNO.1所示氨基酸第98位的精氨酸突变为组氨酸、第305位赖氨酸突变为谷氨酸(PanDR98H-K305E)；(5)SEQIDNO.1所示氨基酸第372位的颉氨酸突变为谷氨酸、403位半胱氨酸突变为亮氨酸(PanDV372E-C403L)；(5)SEQIDNO.1所示氨基酸第98位的精氨酸突变为组氨酸、第305位赖氨酸突变为谷氨酸、第451位的异亮氨酸突变为颉氨酸(PanDR98H-K305E-I451V)；(6)SEQIDNO.1所示氨基酸第325位的色氨酸突变为精氨酸(PanDW325R)。上述任一突变体基因同源性70％以上的核苷酸序列或其编码酶同源性80％以上的氨基酸序列均属于本专利技术要求保护的范围。本专利技术还提供一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体编码基因及其构建的工程菌，所述工程菌是将突变体编码基因的核苷酸序列以pET28a为表达载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主构建获得的。本专利技术提供一种所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体在转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸中的应用，所述的应用为：以含L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体为催化剂，以L-天冬氨酸为底物，以pH7.0磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在37℃、200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，获得β-丙氨酸转化液，分离提取，获得β-丙氨酸。进一步，所述转化体系中，催化剂加入量以湿菌体重量计为1-10g/L(优选10g/L)，所述底物终浓度为50-100g/L(优选50g/L)。进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体基因的工程菌接种于含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养12h；获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量转接于含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃，200r/min下培养至OD600在0.6-0.8，加入终浓度0.2mM异丙基硫代半乳糖苷，然后30℃，200r/min诱导表达培养12h，在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体细胞。本专利技术所述LB培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；所述LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂1％-2％，溶剂为去离子水，pH值自然。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术获得的随机突变改造的L-天冬氨酸-α-脱羧酶通过取代具有氨基酸序列为SEQIDNO.1的来源于Triboliumcastaneum的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的第98位，305位，451位氨基酸位点，获得了比原始酶更高的酶活力和催化稳定性。本专利技术通过比较突变体酶PanDR98H-K305E、PanDR98H-K305E-I451V和未突变酶在偏中性条件下的催化能力，结果发现在pH7.0条件下，突变体酶PanDR98H-K305E、PanDR98H-K305E-I451V催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸的转化率分别为未突变酶的3.33倍、2.76倍。本专利技术构建了两个有意义的突变体，实现了L-天冬氨酸-α-脱羧酶酶活以及稳定性的提高。(四)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本专利技术的保护范围内。实施例1：利用随机突变构建L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体文库利用易错PCR试剂盒(该试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司)在体外向L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因PanD(核苷酸序列为SEQIDNO.2所示，氨基酸序列为SEQIDNO.1所示)引入核苷酸突变。易错PCR反应条件及引物(30μL体系)：浓度1ng/μL的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因(SEQIDNO.2)DNA模板1μL，浓度10μM的引物1和引物2各1μL，10×的易错PCRMix3μL，10×的易错PCR专用dNTP3μL，易错PCR专用MnCl24μL，易错PCR专用dGTP2μL，5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第98位、305位、451位、111位、139位、403位、469位、372位、325位进行单突变或多突变获得的。

【技术特征摘要】
1.一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第98位、305位、451位、111位、139位、403位、469位、372位、325位进行单突变或多突变获得的。2.如权利要求1所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为下列之一：(1)SEQIDNO.1所示氨基酸第469位的丝氨酸突变为脯氨酸；(2)SEQIDNO.1所示氨基酸第111位的脯氨酸突变为丝氨酸；(3)SEQIDNO.1所示氨基酸第139位的谷氨酰胺突变为脯氨酸；(4)SEQIDNO.1所示氨基酸第98位的精氨酸突变为组氨酸、第305位赖氨酸突变为谷氨酸；(5)SEQIDNO.1所示氨基酸第372位的颉氨酸突变为谷氨酸、403位半胱氨酸突变为亮氨酸；(5)SEQIDNO.1所示氨基酸第98位的精氨酸突变为组氨酸、第305位赖氨酸突变为谷氨酸、第451位的异亮氨酸突变为颉氨酸；(6)SEQIDNO.1所示氨基酸第325位的色氨酸突变为精氨酸。3.一种权利要求1所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体编码基因。4.一种由权利要求3所述编码基因构建的工程菌。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：于欣君，陈虹，汪钊，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33