果胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及相对于表现出果胶裂解酶活性的亲本酶表现出改变的果胶裂解酶变体；一种生产此类酶的方法；以及用于在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中使用此类酶的方法。与该亲本酶相比，本发明专利技术的果胶裂解酶变体在洗涤剂中表现出改善的稳定性。

Pectin lyase variants and polynucleotides encoding them

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】果胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸对序列表的引用本申请含有处于计算机可读形式的序列表，该序列表通过引用结合在此。
技术介绍

本专利技术涉及相对于亲本酶表现出改变的果胶裂解酶变体；一种生产此类酶的方法；以及用于在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中使用此类酶的方法。与亲本酶相比，本专利技术的果胶裂解酶变体在洗涤剂中表现出改善的稳定性，和/或例如在洗衣过程和/或衣物和/或餐具洗涤剂中表现出改善的热稳定性。相关技术的说明果胶聚合物是植物细胞壁的重要成分。果胶是一种主链由交替的同聚半乳糖醛酸聚糖(平滑区)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(毛状区)组成的杂多糖。这些平滑区是1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸的线性聚合物。半乳糖醛酸残基可以通常以非随机方式在羧基基团上被不同程度地甲基酯化，其中多个聚半乳糖醛酸嵌段被完全甲基酯化。果胶裂解酶(果胶酶)可以根据它们的优选底物(高度甲基酯化的果胶或低甲基酯化的果胶和聚半乳糖醛酸(果胶酸))以及它们的反应机制(β-消除或水解)进行分类。果胶酶可以主要是内切作用，即在链内随机位点切割聚合物以产生寡聚物混合物；或者它们可以是外切作用，即从聚合物的一端进行攻击并产生单体或二聚体。酶命名法(1992)提供的酶分类中包括了几种作用于果胶平滑区的果胶酶活性，如果胶裂解酶(EC4.2.2.2)、果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、外切聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.9)和外切聚α-半乳糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.82)。已经从不同的细菌属如欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和黄单孢菌属(Xanthomonas)克隆了果胶裂解酶。还描述了从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(Nasser等人(1993)FEBS335:319-326)和芽孢杆菌属(Bacillussp.)YA-14(Kim等人(1994)Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学生物技术和生物化学]58:947-949)克隆果胶裂解酶。来自枯草芽孢杆菌的果胶裂解酶的变体已在专利申请WO2002/092741和WO2003/095638中进行了披露。果胶裂解酶通常特征在于碱性最适pH和对二价阳离子的绝对需要，Ca2+最有刺激性。本专利技术的目的是提供一种细胞壁降解酶变体，一种果胶降解酶变体，尤其是果胶裂解酶变体，当应用于例如洗涤剂或纺织品工业过程中时这些变体表现出相对于亲本果胶裂解酶改善的性能。
技术实现思路
诸位专利技术人现在已发现，果胶裂解酶中的某些氨基酸取代产生与亲本酶相比，在中性或碱性pH范围内具有改善的性能和/或稳定性的酶变体，例如，所述性能和/或稳定性特别是在储存之后和/或在储存期间得以改善。当用于洗涤剂组合物中时，本专利技术的果胶裂解酶变体具有改善的储存稳定性，即在高温下对洗涤剂组分的较低敏感度或改善的稳定性。因此，在一些方面，本专利技术涉及一种果胶裂解酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置编号250、176、124、108、149和325，其中该一个或多个改变独立地是：(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)缺失占据该位置的氨基酸，或者(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，并且其中每个位置对应于具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。在一些方面(例如，上文提及的任何方面)，本专利技术的果胶裂解酶变体包含在选自下组的位置处的一个或多个改变，该组由以下组成：位置250、176、124、325、108和149(例如，按给定顺序)，例如，最优选地，该变体包含位置250处的改变，进一步优选地，该变体包含位置176处的改变；进一步优选地，该变体包含位置124处的改变；进一步优选地，该变体包含位置325处的改变，进一步优选地，该变体包含位置108处的改变，进一步优选地，该变体包含位置149处的改变。根据一个方面的这种变体果胶裂解酶优选地包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、D124Y、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、I325F、I325L、以及I325Y。本专利技术的变体可以包含进一步改变；或者可以是根据另一个方面的变体果胶裂解酶，这些变体果胶裂解酶优选地包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种果胶裂解酶变体，其中所述变体具有果胶裂解酶活性并且包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.05 EP 16178069.71.一种果胶裂解酶变体，其中所述变体具有果胶裂解酶活性并且包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性。2.如权利要求1所述的变体，该变体是与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的亲本果胶裂解酶的变体。3.如权利要求1至2中任一项所述的变体，其中所述改变是带正电荷的氨基酸，优选地所述带正电荷的氨基酸是赖氨酸或精氨酸，进一步优选地，所述改变是在选自下组的位置中的一个或多个中对赖氨酸或精氨酸的取代，该组由以下组成：位置48、49、108、124、和149。4.如权利要求1至2中任一项所述的变体，其中该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、以及S229I+I250N+Q356F。5.一种果胶裂解酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQIDNO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，并且其中每个位置对应于具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。6.如权利要求5所述的变体，该变体是与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的亲本果胶裂解酶的变体。7.如权利要求1至6中任一项所述的变体，其中，与亲本酶相比，该变体具有在洗涤剂中的改善的稳定性或改善的热稳定性，优选地使用半衰期改善因子或残余洗涤性能作为在洗涤剂中的稳定性的量度，进一步优选地使用热漂移测定作为热稳定性的量度。8.一种组合物，该组合物包含如权利要求1至7中任一项所述的变体。9.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物是清洁或洗涤剂组合物，优选地是衣物或餐具洗涤组合物。10.如权利要求8至9中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含：i)一种或多种洗涤剂组分，优选地所述洗涤剂组分选自下组，该组由以下组成：表面活性剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂、漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂、酶稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂、以及增溶剂；和/或ii)一种或多种另外的酶，优选地所述另外的酶选自下组，该组由以下组成：蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、氧化还原酶、半纤维素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、酯酶、阿拉伯聚糖酶、果胶裂解酶、...

【专利技术属性】
技术研发人员：RN莫纳德，PK汉森，FW拉斯穆森，AV杜，JE尼尔森，GP吉珀特，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK