一种农作物逆境防御酶提取液及用其提取酶液的方法技术

本发明专利技术涉及一种农作物逆境防御酶提取液及用其提取酶液的方法，包括去离子水、三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、六水氯化镁和甘油；其中，每500ml溶液中包含3.00‑3.10g重量的三羟甲基氨基甲烷、0.08‑0.09g重量的抗坏血酸、0.07‑0.08g重量的二硫苏糖醇、0.15‑0.16g重量的谷胱甘肽、0.50‑0.60g重量的六水氯化镁以及95‑105ml的甘油，且该农作物逆境防御酶提取液的pH值为6.9‑7.1。该发明专利技术克服了现有农作物逆境研究中对农作物逆境酶中的过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶需要逐个提取，存在步骤繁琐、耗时长等缺点，其采用特别的组分比例配制而成，可一次提取获得过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶这5种酶的酶液，大大简化了试验程序，提高了试验效率，且提取效果好、酶活性稳定。

A Method for Extracting Enzyme Solution from Crop Adversity Defense Enzyme and Using it to Extract Enzyme Solution

The present invention relates to a crop adversity defense enzyme extract and a method for extracting the enzyme solution, including deionized water, trimethylol aminomethane, ascorbic acid, dithiothreitol, glutathione, magnesium chloride hexahydrate and glycerol, in which each 500 ml solution contains 3.00 3.10 g of trimethylol aminomethane, 0.08 0.09g of ascorbic acid and 0.07 0.08g of weight. Dithiothiothreotol, 0.15 0.16 g of glutathione, 0.50 0.60 g of magnesium chloride hexahydrate and 95 105 ml of glycerol, and the pH value of the extract of the crop adversity defense enzyme was 6.9 7.1. The invention overcomes the shortcomings of the existing crop stress studies that the peroxidase, superoxide dismutase, catalase, polyphenol oxidase and phenylalanine ammonia lyase need to be extracted one by one, which are cumbersome and time-consuming. The peroxidase, superoxide dismutase and phenylalanine ammonia lyase can be obtained by one extraction with a special proportion of components. Catalase, polyphenol oxidase and phenylalanine ammonia lyase are the enzymatic solutions of these five enzymes, which greatly simplify the test procedure, improve the test efficiency, and have good extraction effect and stable enzyme activity.

【技术实现步骤摘要】
一种农作物逆境防御酶提取液及用其提取酶液的方法
本专利技术涉及一种农作物逆境防御酶提取液及用其提取酶液的方法，应用在农作物逆境防御酶的研究领域。
技术介绍
过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)是膜保护系统的组成部分，能够清除植物体内的O2-、·OH、1O2、H2O2，减少·OH的形成，维持植物体内的活性氧代谢平衡，保护膜结构，减轻有毒物质对活细胞的毒害，从而使植物能在一定程度上忍耐、抵抗逆境的胁迫。多酚氧化酶(PPO)参与植物体内酚类物质氧化形成醌的保卫反应，能够使一元酚和二元酚氧化生成醌，在植物对病菌侵染的防卫反应中起着重要作用。苯丙氨酸解氨酶(PAL)与细胞壁的重要组分木质素的形成有密切关系，也是植物逆境应激反应的标志性酶。以上5种酶都是植物在逆境条件下产生的防御酶，其酶活性的高低可反应植物逆境应激反应的能力。目前传统方法对这5种酶进行活性测定时，需要按照《植物生理学实验指导》上记载的方法，采用不同方法逐个对各酶的酶液进行提取，之后再进行活性测定，过程比较繁琐。因此，提供一种能够一次即可提取过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶以及苯丙氨酸解氨酶这5种逆境防御酶的操作简便且提取酶液效果佳的农作物逆境防御酶提取液及用其提取酶液的方法可以较大程度地简化试验程序，提高工作效率。
技术实现思路
为了克服现有农作物逆境研究中对农作物逆境酶中的过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶需要逐个提取，存在步骤繁琐、耗时长等缺点，本专利技术提供了一种农作物逆境防御酶提取液，其采用特别的组分比例配制而成，可一次提取获得过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶这5种酶的酶液，大大简化了试验程序，提高了试验效率，且提取效果好、酶活性稳定。本专利技术的技术方案如下：一种农作物逆境防御酶提取液，包括去离子水、三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、六水氯化镁和甘油；其中，每500ml溶液中包含3.00-3.10g重量的三羟甲基氨基甲烷、0.08-0.09g重量的抗坏血酸、0.07-0.08g重量的二硫苏糖醇、0.15-0.16g重量的谷胱甘肽、0.50-0.60g重量的六水氯化镁以及95-105ml的甘油，且该农作物逆境防御酶提取液的pH值为6.9-7.1。其具体的配制方法为：先将称取好的三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽以及六水氯化镁倒入烧杯内，加入适量去离子水将其溶解混合，再向该混合溶液中加入甘油搅拌均匀，并用1-2mol/L的盐酸溶液将其pH值调至6.9-7.1(采用pH计测定)，最后加入去离子水将其定容至500ml，将溶液混匀后装入试剂瓶中，放入4℃冰箱保存备用。采用本申请的农作物逆境防御酶提取液，通过特别的组分比例配合，只需一次提取即可同时获得含有过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶这5种酶的酶液，较现有需要分5次逐个提取以上酶类而言，大大简化了步骤，提升了效率；且其提取效果好，所提取的以上5种酶类的活性与现有采用逐个提取方法所获得的这些酶的酶活性相当，即能达到相同的酶类提取效果，并获得相当酶活性的酶液。该农作物逆境防御酶提取液每500ml溶液中包含3.0285g重量的三羟甲基氨基甲烷、0.0881g重量的抗坏血酸、0.0771g重量的二硫苏糖醇、0.1537g重量的谷胱甘肽、0.5083g重量的六水氯化镁以及100ml的甘油，且该农作物逆境防御酶提取液的pH值为7。优选比例的各组分搭配同时提取过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的效果更好且酶活性稳定。所述农作物逆境防御酶提取液的pH值是采用1-2mol/L盐酸溶液调节的。优选pH调节剂材料易得，调节方便。为了克服现有提取过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶需要逐个提取，存在步骤繁琐、耗时长等缺点，本专利技术提供了一种用上述农作物逆境防御酶提取液提取酶液的方法，其采用特别配制的农作物逆境防御酶提取液并搭配优选工艺，通过一次提取即可获得同时含有过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的酶液，具有能简化试验程序，提高试验效率，且提取效果好、酶活性稳定的优点。一种提取农作物逆境防御酶酶液的方法，包括以下依次进行的步骤：(1)研磨材料：称取所要提取的农作物材料于研磨容器中，加入适量上述的农作物逆境防御酶提取液，再加入适量帮助研磨的石英砂，之后将农作物材料和农作物逆境防御酶提取液的混合物研磨成匀浆；(2)将匀浆移入离心管内：将步骤(1)所得匀浆液全部倒入离心管中，之后用农作物逆境防御酶提取液清洗研磨容器内壁至少1次，每次清洗时加入1.0-1.5ml的农作物逆境防御酶提取液到研磨容器中，每次清洗完将清洗液倒入离心管中；(3)离心：将离心管置于温度3-5℃、转速15000-16000r/min的离心机中离心29-31min；(4)获得酶液：离心后取出离心管，取上部的上清液即为酶液。本申请的提取农作物逆境防御酶酶液的方法采用了前述特别配制的农作物逆境防御酶提取液，并搭配优选工艺，通过一次提取即可同时获得过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶5种酶，且其提取的以上酶的活性与传统采用逐个提取方法获得的酶活性相当。其中，如果农作物材料为茎尖或叶片的话，石英砂的用量为其重量比例的40-50％；如果农作物材料为果肉的话，石英砂的用量为其重量比例的10-20％。所述农作物材料为新鲜的农作物材料或为经液氮冷冻处理后冻存于超低温冰箱中的农作物材料。优选的农作物材料能够保证材料中过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的高酶活性。所述农作物材料为茎尖、叶片或果肉；每0.4-0.5g重量的茎尖或叶片加入4-5ml农作物逆境防御酶提取液，每4-5g重量的果肉加入4-5ml农作物逆境防御酶提取液。优选农作物材料中的过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性更佳。优选农作物材料与农作物逆境防御酶提取液的用量比例能够达到最佳的上述5种酶的提取效果。所述的农作物逆境防御酶提取液是冷藏保存于3-5℃冰箱中的。采用该农作物逆境防御酶提取液能够保证过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的酶活性稳定。提取获得酶液后，将该酶液于3-5℃冰箱中保存。优选酶液保存方式能很好地保证过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的酶活性稳定。所述研磨容器使用前于3-5℃的冰箱内预冷，使用时置于冰袋上，于冰浴状态下进行步骤(1)。优选研磨容器的处理方式能最大限度保证过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的酶活性稳定。步骤(2)中用农作物逆境防御酶提取液清洗研磨容器内壁的次数在3次以上。多次清洗研磨容器内壁能最大限度地获得过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶。与现有技术相比，本专利技术申请具有以下优点：1)本申请的农作物逆境防御酶提取液通过特别组分的比例配合，一次提取即可同时获得过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、多酚氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农作物逆境防御酶提取液，其特征在于：包括去离子水、三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、六水氯化镁和甘油；其中，每500ml溶液中包含3.00‑3.10g重量的三羟甲基氨基甲烷、0.08‑0.09g重量的抗坏血酸、0.07‑0.08g重量的二硫苏糖醇、0.15‑0.16g重量的谷胱甘肽、0.50‑0.60g重量的六水氯化镁以及95‑105ml的甘油，且该农作物逆境防御酶提取液的pH值为6.9‑7.1。

【技术特征摘要】
1.一种农作物逆境防御酶提取液，其特征在于：包括去离子水、三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、六水氯化镁和甘油；其中，每500ml溶液中包含3.00-3.10g重量的三羟甲基氨基甲烷、0.08-0.09g重量的抗坏血酸、0.07-0.08g重量的二硫苏糖醇、0.15-0.16g重量的谷胱甘肽、0.50-0.60g重量的六水氯化镁以及95-105ml的甘油，且该农作物逆境防御酶提取液的pH值为6.9-7.1。2.根据权利要求1所述的农作物逆境防御酶提取液，其特征在于：每500ml溶液中包含3.0285g重量的三羟甲基氨基甲烷、0.0881g重量的抗坏血酸、0.0771g重量的二硫苏糖醇、0.1537g重量的谷胱甘肽、0.5083g重量的六水氯化镁以及100ml的甘油，且该农作物逆境防御酶提取液的pH值为7。3.根据权利要求1所述的农作物逆境防御酶提取液，其特征在于：所述农作物逆境防御酶提取液的pH值是采用1-2mol/L盐酸溶液调节的。4.一种提取农作物逆境防御酶酶液的方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：(1)研磨材料：称取所要提取的农作物材料于研磨容器中，加入适量权利要求1-3任一项所述的农作物逆境防御酶提取液，再加入适量帮助研磨的石英砂，之后将农作物材料和农作物逆境防御酶提取液的混合物研磨成匀浆；(2)将匀浆移入离心管内：将步骤(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小红，鄢铮，骆志坚，赵依杰，林强，
申请(专利权)人：福州市农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35