用作PCR防腐剂的裂解酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，尤其涉及一种用作PCR防腐剂的裂解酶，该裂解酶的基因表达序列如Seq ID No.1所示。本发明专利技术提供的用作PCR防腐剂的裂解酶，具有广谱抗菌能力。以该裂解酶作为一种新型防腐剂，用于聚合酶链式反应(PCR)可以有效抑制缓冲液中微生物的生长，提高缓冲液的稳定性。与传统PCR体外诊断试剂防腐剂相比，该裂解酶属于无毒的生物防腐剂，对人体没有伤害。另外，本发明专利技术实施例提供的裂解酶作为PCR防腐剂，对PCR反应有一定的促进作用。

Pyrolytic Enzymes Used as Preservatives for PCR and Their Preparation and Application

The invention belongs to the field of bioengineering technology, in particular to a lyase used as a PCR preservative, and the gene expression sequence of the lyase is shown in Seq ID No.1. The lyase provided by the invention as a PCR preservative has broad-spectrum antimicrobial ability. Polymerase chain reaction (PCR) using the lyase as a new preservative can effectively inhibit the growth of microorganisms in the buffer and improve the stability of the buffer. Compared with the traditional in vitro diagnostic reagent preservatives of PCR, the lyase is a non-toxic biological preservative, and has no harm to human body. In addition, the lyase provided by the embodiment of the present invention acts as a PCR preservative and has a certain promoting effect on the PCR reaction.

【技术实现步骤摘要】
用作PCR防腐剂的裂解酶及其制备方法和应用
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种用作PCR防腐剂的裂解酶及其制备方法和应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR是利用DNA在体外摄氏95℃左右的高温时会变性成单链，60℃左右的低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP等反应组分就可以完成特定基因的体外复制。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火(复性)和引物的延伸三个步骤。当今PCR是分子生物学中使用最广泛的技术之一，常被用于生物医学研究、传染病诊断和分子考古学。PCR实验的成功取决于一系列因素，其中反应组分在扩增汇总中起到了至关重要的作用，这些反应组分主要包括模板DNA、DNA聚合酶、引物、dNTP脱氧核苷酸、镁离子和PCR缓冲液六个部分。其中，PCR缓冲液，是由弱碱及其共轭碱盐类组成的缓冲对配置，能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境，pH通常为8.0-9.5。PCR缓冲液的主要成分包括Tris和HCl，而一些微生物能够利用其中的碳源生长，从而影响PCR缓冲液的性能，进而影响PCR反应。因此，对于长期保存的PCR缓冲液，在其中加入防腐剂是一种防止缓冲液染菌的方法，常见的防腐剂包括叠氮钠、硫柳汞、脱氢醋酸钠、Proclin300等。但是，常见防腐剂都相应存在一些不足之处。叠氮钠，能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，属于剧毒化合物，半数致死量为27mg/kg，对细胞色素氧化酶和其他酶有抑制作用，并能使体内氧合血红蛋白形成受阻，机除对眼和皮肤有刺激性外，还可经吸入、口服或皮肤吸收引起中毒死亡，遇高热或剧烈震动能强烈爆炸，使用的安全性是其作为防腐剂的制约因素。且叠氮钠对多种酶有抑制作用，可能影响PCR反应。硫柳汞，含有少量有机汞，在理论上具有神经毒性，因此其安全性也是其作为防腐剂使用的制约因素。脱氢醋酸钠，当量为0.03％-0.05％时，对PCR反应会有一定的抑制作用，因此制约了其作为防腐剂应用于PCR体外诊断试剂。庆大霉素，属于抗生物，其缺点是容易产生耐药性而使其作用降低或丧失。Proclin300，在遇到铵、亚硫酸盐、强还原剂或处在强碱性环境中时，活性会降低，在过量使用的情况下有一定的刺激性和致敏性。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种用作PCR防腐剂的裂解酶，旨在解决现有聚合酶链式反应防腐剂对生物体的毒害作用，且对PCR反应有抑制作用的技术问题。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种PCR防腐剂。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法。本专利技术实施例的又一目的在于提供一种PCR防腐剂在PCR缓冲溶液中的应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种用作PCR防腐剂的裂解酶，所述裂解酶的基因表达序列如SeqIDNo.1所示。一种PCR防腐剂，包括裂解酶，所述裂解酶为上述的裂解酶。相应地，一种用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，包括以下步骤：获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列；根据所述裂解酶的基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，获得裂解酶扩增片段；将所述裂解酶扩增片段与质粒相连，转入克隆宿主菌获得含裂解酶重组质粒的克隆菌株；培养所述含有裂解酶重组质粒的克隆宿主菌，至菌液的OD600值为0.6～0.8，提取裂解酶重组质粒，转入表达宿主菌构建含裂解酶重组质粒的表达菌株；用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株，获得裂解酶蛋白。进一步地，所述获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列的方法为：从NCBI数据库获取亚栖热菌噬菌体P23-45的DNA序列；使用NCBI的CD-Search功能分析获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶序列；合成所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列。进一步地，所述引物包括：引物P1和引物P2，所述引物P1的序列如SeqIDNo.2所示，所述引物P2的序列如SeqIDNo.3所示。进一步地，所述将所述裂解酶扩增片段与质粒相连的方法为：将所述裂解酶扩增片段与质粒使用EcoRI与HindIII进行双酶切，得到带有粘性末端的线性质粒载体和裂解酶的目的片段，将所述线性质粒载体和所述裂解酶的目的片段连接得到重组质粒。进一步地，所述克隆宿主菌选自：DH5α菌种、Top10菌种或GM3819菌种中的一种。进一步地，所述表达宿主菌选自：Rosetta2菌株、Rosetta-gami2菌株、Rosetta-gamiB菌株、RosettaBlue菌株或BL21(DE3)菌种中的一种。进一步地，所述用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株的条件为：IPTG的终浓度为0.8～1.2mM，诱导温度为25～35℃，诱导转速为60～100rpm，诱导时间为4～8小时。一种PCR缓冲溶液，以所述PCR缓冲溶液的重量为100％计，所述PCR缓冲溶液包括1％～2％的上述PCR防腐剂。本专利技术提供的用作PCR防腐剂的裂解酶，具有广谱抗菌能力。以该裂解酶作为一种新型防腐剂，用于聚合酶链式反应(PCR)可以有效抑制缓冲液中微生物的生长，提高缓冲液的稳定性。与传统PCR体外诊断试剂防腐剂相比，该裂解酶属于无毒的生物防腐剂，对人体没有伤害。另外，本专利技术实施例提供的裂解酶作为PCR防腐剂，对PCR反应有一定的促进作用。本专利技术提供的PCR防腐剂，由于包括上述序列的裂解酶，而上述裂解酶具有广谱的抗菌能力，因而本专利技术实施例提供的PCR防腐剂也具有广谱的抗菌能力，能有效抑制PCR溶液中微生物的生长，提高溶液的稳定性，从而促进PCR反应的进行。本专利技术提供的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，通过根据获取的亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，再通过克隆、表达、IPTG诱导，获得裂解酶蛋白。该裂解酶蛋白可用作PCR防腐剂。该裂解酶的制备方法，通过采用简单的方法即可实现裂解酶的制备，操作简便，可实现批量化生产，适于工业应用。本专利技术提供的PCR缓冲溶液，含有1％～2％上述PCR防腐剂，该防腐剂包括分离自亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶，因此，该防腐剂具有广谱的抗菌能力，可以有效抑制PCR缓冲液中微生物的生长，提高缓冲液的稳定性。且该PCR防腐剂无毒性，对人体没有伤害，所以该PCR缓冲溶液也无毒无害。附图说明图1是本专利技术实施例提供的裂解酶蛋白的纯化结果：左边为蛋白标准分子量，右边为裂解酶蛋白。图2是本专利技术实施例提供的裂解酶蛋白在PCR反应缓冲溶液Buffer中的抑菌效果对比图。图3是本专利技术实施例提供的裂解酶蛋白对PCR反应扩增效果对比图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用作PCR防腐剂的裂解酶，其特征在于，所述裂解酶的基因表达序列如Seq ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种用作PCR防腐剂的裂解酶，其特征在于，所述裂解酶的基因表达序列如SeqIDNo.1所示。2.一种PCR防腐剂，其特征在于，包括裂解酶，所述裂解酶为权利要求1所述的裂解酶。3.一种如权利要求1所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列；根据所述裂解酶的基因序列设计引物，PCR扩增所述裂解酶，获得裂解酶扩增片段；将所述裂解酶扩增片段与质粒相连接，转入克隆宿主菌获得含裂解酶重组质粒的克隆菌株；培养所述含有裂解酶重组质粒的克隆宿主菌，至菌液的OD600值为0.6～0.8，提取裂解酶重组质粒，转入表达宿主菌构建含裂解酶重组质粒的表达菌株；用IPTG诱导所述含裂解酶重组质粒的表达菌株，获得裂解酶蛋白。4.如权利要求3所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，所述获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列的方法为：从NCBI数据库获取亚栖热菌噬菌体P23-45的DNA序列；使用NCBI的CD-Search功能分析获取所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶序列；合成所述亚栖热菌噬菌体P23-45的裂解酶的基因序列。5.如权利要求3所述的用作PCR防腐剂的裂解酶的制备方法，其特征在于，所述引物包括：引物P1和引物P2，所述引物P1的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶俊炜，田仁鹏，吴成贡，杜维，窦文祥，
申请(专利权)人：深圳生科原生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44