本发明专利技术公开了一种海藻酸裂解酶SHA-2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明专利技术构建了海藻酸裂解酶基因SHA-2的原核表达载体，该原核表达载体能够在较短时间内获得表达产物海藻酸裂解酶SHA-2，且具有广泛的底物特异性，既能利用聚甘露糖醛酸（Poly-mannuronate，PolyM）也能利用聚古罗糖醛酸（Poly-guluronate，PolyG）为底物，酶活达到5.2U/mg，是一种具有广泛应用前景的双功能酶，本发明专利技术原核表达载体和整体表达系统容易操作，便于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及一种海藻酸裂解酶SHA-2基因及其原核表达载体PGEX-4T-1-5B4-么该载体高效表达海藻酸裂解酶蛋白SHA-2。
技术介绍
近年来海洋资源的开发利用已逐渐成为研宄的热点，海藻酸因其独特的理化性质在食品、医药和化工等领域具有广泛的应用前景。海藻酸寡糖因具有多种生理活性，成为开发新药的聚焦点。同时海藻酸作为最丰富的海洋生物质之一，因具有以下优势:(1)光合作用效率高，生长快，产量高，资源丰富；(2)生长不占用耕地；(3)几乎不含有木质素，纤维素的含量少，预处理简单，便于微生物的利用和发酵；从而在生物能源领域受到了广泛的关注。目前，降解海藻酸的方法可分为三大类:第一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸。第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一的酶制剂或使用不同底物专一性组合的酶制剂。海藻酸裂解酶主要由海藻酸分解菌和一些海洋动植物等产生，具有很大的应用前景。但野生型海藻酸分解菌产酶量低且成本高，很难达到实际的应用要求。因此，通过基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。1993年，Boyd等首次克隆了 Pseudomorms海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌中进行了表达，其粗酶液活性达到146U/mg。1996年Frederic等将Pseudomonas 中编码海藻酸裂解酶的基因aly在大肠杆菌中表达，其催化活性达到97U/mg。2009 年，GaofeiPseudoalteromonas sp.CY24 中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，并在大肠杆菌中进行表达，得到一个催化活性为121.6U/mg，分子量为58KD的蛋白。2012年，Hwan Hee Park等利用sp.MJ-3的基因组构建基因文库，筛选得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并将其在大肠杆菌中表达，得到了一种对PolyM和PolyG都有活性的双功能酶。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种海藻酸裂解酶SHA-2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本海藻酸裂解酶SHA-2基因来源于厌氧海藻酸分解菌Marinicatena alginatilyticaSH-52(保藏编号为CCTCC NO:M2013073),由本实验室全基因组测序获得，通过BLAST比对，结果显示与及galactanivorans strain DsiJT的海藻酸裂解酶亲缘关系相似度为74%。本专利技术的另一目的是提供海藻酸裂解酶SHA-2基因的原核表达载体，该载体含有Ptac启动子、终止子和海藻酸裂解酶基因5??-么细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，SM-2基因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游为可被IPTG诱导的操纵子序列，紧靠基因起始密码子上游的是一个GST标签序列，可生成融合表达蛋白，之后通过凝血酶可将GST标签切除而不影响目的蛋白的结构活性。本专利技术的另一个目的是将海藻酸裂解酶SHA-2基因的原核表达载体应用在制备海藻酸裂解酶SHA-2中。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案: I > Marini ca tena algina ti Iyti ca SH-52海藻酸裂解酶基因的获得和原核表达载体的构建 (1)根据alginati Iyti ca SH-52海藻酸裂解酶基因编码框序列和原核表达载体PGEX-4T-1多克隆位点，设计I对特异引物如下:SHA-2-F:5’ - GGATCCATGAAAAAATCAAGCTTTTTAC-3’ SHA-2-R: 5’ -GCGGCCGCTCAATCCTGACCAGGCG-3’，在上下游引物的 5’ 端分别加入 BamH I和Not I酶切位点(下划线为酶切位点)；提取iferiflicaiefla algina ti lytica SH-52的基因组，使用上述引物进行扩增； (2)回收并纯化海藻酸裂解酶全长基因片段，并将其连接到PMD19-T载体上，采用SDS-碱裂解法提取质粒DNA，通过双酶切检测获得重组质粒pMD19T-5B4-J?; (3)构建原核表达载体PGEX-4T-1-5B4-么用BamHI和Not I双酶切pMD19T_5B4-满口PGEX-4T-1，并回收纯化海藻酸裂解酶基因片段及pGEX_4T_l载体片段，然后连接、转化、抽提质粒进行双酶切验证，获得原核表达载体PGEX-4T-1-5B4-么进行测序后，将测序结果进行生物信息学分析。2、海藻酸裂解酶SHA-2的原核表达 使用热激法将pGEX-4T-l-5B4-1转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，通过IPTG诱导下筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达； 3、海藻酸裂解酶SHA-2的蛋白纯化 收集菌体，进行超声破碎，得到的上清通过GST琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集纯化后的蛋白用于SHA-2的蛋白表达检测及下一阶段实验。4、重组海藻酸裂解酶SHA-2的特性研宄 对纯化后的海藻酸裂解酶SHA-2进行以下特性研宄:最适温度，最适pH等，本专利技术获得的重组海藻酸裂解酶SHA-2，其最适温度为65°C，最适pH为7.5 ;本专利技术中采用的测定方法为常规海藻酸裂解酶酶活性测定方法，测定反应底物在A235nm处吸光值的变化。本专利技术对来源于厌氧海藻酸分解菌alginatilytica SH-52中的新型海藻酸裂解酶基因进行了扩增，并进一步进行原核表达和蛋白纯化，获得了 SHA-2蛋白。现有技术海藻酸裂解酶的野生菌株通过发酵培养到产酶，至少需要3天的时间，而本专利技术的基因工程菌株只需6h即可获得最大量的目的蛋白，本专利技术所获得的重组海藻酸裂解酶SHA-2蛋白具有广泛的底物特异性，既能利用PolyM也能利用PolyG为底物，酶活可以达到5.2U/mg，是一种具有广阔应用前景的双功能酶，本专利技术原核表达载体及整体表达系统容易操作，便于工业化生产；本专利技术解决了现有的产海藻酸裂解酶菌株酶产量较低的问题，也为进一步对海藻酸裂解酶SHA-2进行机理及机制研宄奠定了基础。【附图说明】图1 是本专利技术 Marinicatena algina ti Iyti ca SH-52 基因组 DNA 的检测，图中:M是DNA marker ;1和2是基因组DNA ； 图2是本专利技术海藻酸裂解酶基因的TA克隆策略示意图； 图3是本专利技术重组质粒pMD19T-5B4-1的电泳检测示意图，图中:M是DNA marker ;1_4是 PMD19T-5B4-名 图4是本专利技术重组质粒pMD19T-5B4-1的双酶切检测示意图，图中:M是DNA marker ；1-4 是 BamH I 与 Not I 双酶切的 pMD19T-5B4_i质粒； 图5是本专利技术重组质粒PMD19T-5B4-雄JPCR检验示意图，图中:M是DNA marker ;6为阴性对照，1-5是以pMD19T-5B4-1为模板，用SHA-2-F，SHA-2-R为引物扩增的PCR产物； 图6是本专利技术海藻酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海藻酸裂解酶SHA‑2基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：伊日布斯，何漫漫，李勤超，吴铭杰，严金平，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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