一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法，该方法包括：（1）、提供胚胎干细胞悬浮液，其中悬浮液中包括拟胚体（EB）培养液；（2）、将胚胎干细胞悬浮液接种到第一细胞培养皿中的第一初始位置，培养2‑3天后；（3）、将初始位置的胚胎干细胞悬浮液从第一培养皿中移除，并放入第二培养皿中第二初始位置培养2‑5天，其中，继续培养第一细胞培养皿中的细胞直至80‑90%以上的汇合度；循环步骤（2）和（3）。这样可以连续循环活动大量高纯度的间充质干细胞,成本低廉。

A Rapid Method for Obtaining Large Quantity of High Purity Mesenchymal Stem Cells

The invention provides a method for rapidly obtaining a large number of high purity mesenchymal stem cells, which includes: (1) providing embryonic stem cell suspension, in which the suspension includes embryoid body (EB) culture medium; (2) inoculating embryonic stem cell suspension into the first initial position of the first cell culture dish, after 2 to 3 days of culture; (3) drying the embryo at the initial position. Cell suspension was removed from the first culture dish and cultured in the second initial position of the second culture dish for 2 to 5 days. Cells in the first culture dish were cultured until the confluence degree was over 80 to 90%. Cyclic steps (2) and (3). In this way, a large number of high purity mesenchymal stem cells can be circulated continuously, and the cost is low.

【技术实现步骤摘要】
一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法
本专利技术属生物
，涉及使用人胚胎干细胞分化获得高纯度间充质干细胞的方法。
技术介绍
干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，干细胞技术在临床上的应用代表着医学发展的一大方向。按照发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞来自囊胚期的内细胞团，具有无限增殖和三胚层分化潜能。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是最具代表性的成体干细胞之一，MSCs是属于中胚层的一类多潜能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，国际干细胞协会对人MSCs的鉴定做了规定，且要求以下三点同时满足。(1)MSCs在标准培养条件下能贴壁生长;(2)MSCs表达CD105、CD73和CD90,不表达CD45、CD14、CD11b、HLA-DR、CD79α或CD119，其中CD105、CD73、CD90的阳性率应≥95%，其他阴性标志物的阳性率应≤2%；(3)MSCs在体外能向成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞分化。MSCs表面表达MHCⅠ类分子，但不表达MHCⅡ分子，同时MSCs也不表达共刺激分子CD40,CD80和CD86。虽然MSCs表面表达的MHCⅠ类分子会激活T细胞，但共刺激分子的缺失表达致使第二信号不能产生，因此异体应用MSCs不会引起免疫排斥反应。除具备自我复制和多系分化的潜能外，MSCs还通过分泌转化生长因子β肝细胞生长因子、一氧化氮/吲哚昔酚、白介素10、白介素6、白介素-1受体α、人白细胞抗原-G、前列腺素E2等多种可溶性因子实现免疫调节、支持造血、促血管新生等生物学功能。MSCs分泌的胞外膜泡(主要包括外泌体和微泡)也具有调控免疫反应、减轻氧化应激和组织纤维化等作用，在移植物抗宿主病、急性心梗、肝脏疾病等都发挥了治疗作用。MSCs能够定向归巢到炎症部位，发挥免疫调节作用，而且在不同的炎症微环境下MSCs能够发挥截然相反的作用。在炎症的早期,MSCs能够促进炎症反应，有利于病菌的清除，而到了炎症反应的中晚期，为了抑制过度炎症反应对组织造成的损伤，MSCs会改变表型，发挥抑制T细胞、B细胞、树突状细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞活化的作用。所以，间充质干细胞（MSCs）具有强大的增殖能力和分化能力，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和基质细胞等多种细胞的能力。间充质干细胞由于具备多向分化和免疫调节功能，因此在治疗一些退行性和自身免疫性疾病等方面具有广阔的临床应用前景。间充质干细胞可以从骨髓、脂肪组织、外周血和脐带血等不同的组织和器官里分离得到。从骨髓虽然可以分离到较多的MSC，但是需要通过做手术才能获得，脂肪组织、外周血和脐带血方便获得，但是分离出的MSC数量偏少，同时也会受到供体疾病、体质、年龄的影响，质量不可靠，数量也有限。因此从这些组织和器官分离MSC并不是高效的方式。将人ESCs（胚胎干细胞）诱导分化为间充质干细胞，即人胚胎干细胞源性间充质干细胞(humanembryonicstemcellderivedmesenchymalstemcells,hESC-MSCs)（hESC-MSCs意思是人胚胎干细胞来源的间充质干细胞，和成体MSC具有相似的性质）。hESC-MSCs与成体MSCs具有相似的生物学特性和功能，来源丰富,不产生畸胎瘤，均一性好。hESC-MSCs结合了ESCs和成体MSCs的优点，为临床应用提供了充足的MSCs来源。目前hESC-MSCs的诱导方法主要有三种：拟胚体诱导法、饲养层法及培养基直接诱导法。拟胚体诱导法是hESCs诱导分化的经典途径，通过拟胚体的形成启动分化过程，进而诱导获得MSCs。然而，由于拟胚体内部分化不均一，导致MSCs的纯化过程较长。饲养层法一般是将骨髓基质细胞系作为饲养层，诱导获得MSCs细胞（培养的目标细胞，例如hESC-MSCs），然而，在诱导过程中，由于诱导MSCs与作为基质细胞的骨髓细胞具有类似的形态，因此分化过程不易观察，获得的细胞需通过流式细胞进行分选纯化，增加了细胞的损失和实验步骤，且获得的细胞容易被动物源性成分污染，不利于hESC-MSCs的后期应用。虽然培养基直接诱导法步骤简单，可避免由于饲养层细胞的使用导致的细胞污染问题。然而，该诱导方法中血清浓度较高，不能很好地抑制其他成纤维样细胞的分化，初始获得的MSCs纯度不高，需通过数次传代或流式分选进行纯化，延长了诱导时间（一般是1-2个月）。这就需要对传统的方法进行改进，期望可以获得大量纯度高的细胞，同时显著降低成本。
技术实现思路
针对传统的技术缺陷，我们专利技术小组专利技术了手工纯化hESC-MSCs的方法，避免培养非MSC细胞，可以较快地获得大量高纯度的hESC-MSCs，避免了使用抗体标记以及流式细胞仪进行纯化，节约了时间和成本。所以，本专利技术提供的方法包括如下：（1）、提供胚胎干细胞悬浮液，其中悬浮液中包括拟胚体（EB）培养液；（2）、将胚胎干细胞悬浮液接种到第一细胞培养皿中的第一初始位置，培养2-3天后；（3）、将初始位置的胚胎干细胞悬浮液从第一培养皿中移除，并放入第二培养皿中第二初始位置培养2-5天，其中，继续培养第一细胞培养皿中的细胞直至90%以上的汇合度；循环步骤（2）和（3）。在一些优选的方式中，该方法还包括胚胎干细胞悬浮液的准备步骤，包括如下步骤：6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2mlDMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟。在另一些优选的方式中，将静置的离心管中的上清液去掉，加入2ml拟胚体（EB）培养液（DMEM+KSR+L-glutaine+NEAA），用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中，二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次。在一些优选的方式中，在循环步骤中，可以从第二培养皿中取出第二初始位子的拟胚体（EB）培养液的细胞放入第第三培养皿的第三初始位置进行培养，同时对第二培养皿中剩余的细胞进行培养直至90%以上的汇合度。在优选的方式中，对第三培养皿中剩余的细胞进行培养2-5天。在一些优选的方式中，取走初始位置的拟胚体（EB）培养液的培养皿继续培养5天。本专利技术提供一种大量培养间充质干细胞的方法，包括：1、6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2mlDMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟；2、弃上清，加入2ml拟胚体（EB）培养液（DMEM+KSR+L-glutaine+NEAA），用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中，二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次；3、第6天将形成的EB接种到第一个6孔板中，培养2天后，EB周围会爬出类似MSC的细胞，再过3天有大量MSC爬出，将EB中心的部分用移液器挑出来放入第二个6孔板中培养，剩下的MSC细胞继续培养至90%的汇合度；4、EB中心部分在新的培养皿里继续生长，5天后周围又长出新的MSC，将EB中心部分再次挑出，放入新的第三个培养皿培养，剩下的M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法，该方法包括：（1）、提供胚胎干细胞悬浮液，其中悬浮液中包括拟胚体（EB）培养液； （2）、将胚胎干细胞悬浮液接种到第一细胞培养皿中的第一初始位置，培养2‑3天后； （3）、将初始位置的胚胎干细胞悬浮液从第一培养皿中移除，并放入第二培养皿中第二初始位置培养2‑5天，其中，继续培养第一细胞培养皿中的细胞直至80‑90%以上的汇合度；循环步骤（2）和（3）。

【技术特征摘要】
1.一种快速获得大量高纯度的间充质干细胞的方法，该方法包括：（1）、提供胚胎干细胞悬浮液，其中悬浮液中包括拟胚体（EB）培养液；（2）、将胚胎干细胞悬浮液接种到第一细胞培养皿中的第一初始位置，培养2-3天后；（3）、将初始位置的胚胎干细胞悬浮液从第一培养皿中移除，并放入第二培养皿中第二初始位置培养2-5天，其中，继续培养第一细胞培养皿中的细胞直至80-90%以上的汇合度；循环步骤（2）和（3）。2.根据权利要求1所述的方法，其中，第二次初始培养的时间为2天。3.根据权利要求1所述的方法，其中，第一次初始培养的时间为2天。4.根据权利要求1所述的方法，其中，培养的细胞汇合度为90%以上。5.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括胚胎干细胞悬浮液的准备步骤，包括如下步骤：6孔板中培养的胚胎干细胞用中性蛋白酶在37度培养箱消化5分钟后，弃去中性蛋白酶，加入2mlDMEM培养液，使用1ml无菌注射器的推杆刮掉ESC的克隆，将细胞悬液加入15ml离心管中，静置5分钟。6.根据权利要求5所述的方法，其中，将静置的离心管中的上清液去掉，加入2ml拟胚体（EB）培养液，其具体组分包括：DMEM，KSR，L-glutaine和NEAA，用5ml血清管重悬细胞，加入超低吸附6孔板中，二氧化碳培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次。7.根据权利要求1所述的方法，其中，在循环步骤中，可以从第二培养皿中取出第二初始位子的拟胚体（EB）培养液的细胞放入第第三培养皿的第三初始...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹彤，哈里什·德瑞，曹哲厚，吴立前，韦俊，维克拉姆·帕尔，
申请(专利权)人：杭州原生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33