一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法技术

本发明专利技术公开了一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法，包括人和小鼠的胚胎干细胞在本发明专利技术的这小分子状态下的传代和培养，以及本发明专利技术对细胞自我更新状态的观察与检测。本发明专利技术通过添加CID755673小分子解决了目前传统培养条件下小鼠与人胚胎干细胞状态易分化、传代操作复杂、培养条件成本高和不利于后续机制研究等问题，具有效果稳定、经济高效、操作简单、便于研究等优点，同时也为改善和建立其他种类和物种的多能干细胞的培养条件提供线索，对于未来干细胞基础与应用研究的顺利开展具有积极的推动作用。

An Application Method of Small Molecules to Promote the Self-renewal of Embryonic Stem Cells

The invention discloses an application method of small molecule promoting self-renewal of embryonic stem cells, including the passage and culture of human and mouse embryonic stem cells in the small molecule state of the invention, and the observation and detection of cell self-renewal state. The invention solves the problems of easy differentiation of mouse and human embryonic stem cells under traditional culture conditions, complex operation of passage, high cost of culture conditions and unfavorable to follow-up mechanism research by adding small molecule CID755673, and has the advantages of stable effect, high economic efficiency, simple operation, easy research, etc. At the same time, it also improves and establishes the pluripotent stem cells of other species and species. Culturing conditions provide clues, which will play a positive role in promoting the smooth development of basic and applied research of stem cells in the future.

【技术实现步骤摘要】
一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法。
技术介绍
干细胞是一类来自胎儿、胚胎或成体内且在一定条件下具有无限的自我更新与增殖分化能力的一类细胞。一定条件下胚胎干细胞可被诱导分化为各种组织，这一特性使其在基础研究、移植治疗和基因治疗中具有诱人的应用前景，胚胎干细胞在体外适宜条件下，能够在未分化状态下无限增殖，这为胚胎干细胞进行的研究和应用提供了用之不竭的细胞来源。胚胎干细胞的这两种主要特性现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一，在再生医学领域具有巨大的应用前景。目前研究得最为广泛的干细胞是小鼠胚胎干细胞（moµseEmbryonicStemCells，mESCs），小鼠胚胎干细胞来源于着床前胚胎（怀孕第3.5天）的内细胞团具有发育的多能性，这也是第一株在体外成功建立的干细胞系。之后，人的胚胎干细胞（humanEmbryonicStemCells，hESCs）系也得以成功构建，hESCs是由人的早期胚胎内细胞团或hPGCs经过体外分化抑制培养，分离出来的多潜能细胞，有着极为广泛的应用前景。小鼠与人ESCs虽然拥有一些共同的特征，但二者的生物学特性却有诸多不同之处。CID755673小分子维持人和小鼠胚胎干细胞的自我更新状态，也避免了人和小鼠在培养过程中出现分化状态提供了一个新思路。其本身也是对于整个干细胞领域探究深度与广度的扩充，因而具有重要的科研价值与学术意义，相关成果有助于未来对于干细胞的安全应用。人和小鼠的胚胎干细胞的维持需要特定的营养物质及细胞因子，若无这些细胞因子胚胎干细胞会出现分化现象，我们发现的CID755673化学小分子能够在不加入一些细胞因子的条件下促进胚胎干细胞的自我更新，而这可以作为胚胎干细胞的未来的培养条件，丰富了胚胎干细胞培养条件的种类，优化了胚胎干细胞的培养条件。虽然优化后的CID755673培养条件可以维持胚胎干细胞的自我更新状态，但由于所涉及的细胞因子种类过多，不利于后续对于细胞内相关信号通路与分子机制的深入探究，且培养成本高。本专利技术在此基础上，通过逐个递减与对不同排列组合的尝试，进一步改进与优化人和小鼠的自我更新条件，优化后的条件仅使用两种小分子即可维持小鼠胚胎干细胞的自我更新状态，一类小分子即可促进人的胚胎的自我更新，达到与原培养条件相同的培养效果，具有省时、省力、省钱、利于后续研究等优点。
技术实现思路
本专利技术为了解决胚胎干细胞培养过程中出现易分化、传代操作不方便等问题，提供一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法，在DMEM培养基、N2B27+KSR的培养基中，加入CID755673小分子化合物来维持小鼠和人的胚胎干细胞的自我更新状态，包括人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养和小鼠的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养。所述的人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养，包括以下步骤：（1）取一个6孔细胞培养板，每孔用2mlDMEM+10µlMatrigel包板，置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内，包被4h；（2）取生长至70-80%密度的人的胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，除去细胞表面残留的培养液；（3）加入1mlCTK消化胚胎干细胞，6-8min后，细胞边缘浮起，弃CTK，加2ml含10%FBS的常规细胞培养液，用移液器吹打，将细胞从培养板上吹打下来，然后转移至15ml无菌离心管中；（4）1200rpm，离心4min后，吸去上清；（5）加2ml含10%KSR的N2B27重悬细胞；（6）在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；（7）取已包被好的培养皿，弃包板溶液，PBS洗一遍，向培养板每孔内加入2mlN2B27+KSR培养基；（8）向培养基中加入5×104个细胞，水平十字形晃动，使细胞均匀分布；（9）加入10µmol的CID755673小分子，水平十字形晃动，使其混合均匀；（10）将细胞培养皿置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内培养。所述步骤3中的CTK含有1%CollagenaseIV、0.25%Trypsin、20%KSR、1mMCaCl2的PBS。所述步骤5中的N2B27每5ml含有1.875mlDMEM/F12，0.25mlN2，1.875mlNeurobasalmedium，0.5mlB27，2mML-glµtamine，0.1mMβ-mercaptoethanol。所述应用中加入小分子CRT0066101可以维持人的胚胎干细胞的长期自我更新状态。所述的小鼠的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养，包括以下步骤：（1）取一个6孔细胞培养板，每孔用2mlGelatin包板，置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内，包被1h；（2）取生长密度55-65%的稳定的细胞系，弃培养液，PBS缓冲液小心洗涤1次，弃净残留洗涤液；（3）立即加入1ml胰酶消化液消化细胞，待数分钟后细胞集落边缘浮起，用微量移液器小心吹散并转移至含有2mlDMEM血清培养液的15ml离心管中，继续小心吹打混匀，终止消化；（4）将离心管中的混合悬液于1000rpm离心约3min，弃上清加入1mlPBS缓冲液洗涤并再次离心；（5）弃上清加入适量DMEM血清培养液重悬细胞，并进行细胞计数；（6）取适量细胞悬液于15ml离心管，加入适量DMEM血清培养基至总体积2ml，加入2µmolCID755673小分子，小心吹打混匀；（7）取包被好的细胞培养皿，弃明胶，将上步的2ml的悬液转移至培养皿，水平交叉十字法滑动，使细胞和小分子分布均匀；（8）将细胞培养皿置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内培养，每天观察细胞形态及生长状况，并隔天换培养液。所述小鼠的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养中加入CID755673和PD0325901两种小分子，能够维持小鼠的胚胎干细胞维持长期的自我更新状态。本专利技术的优点是：（1）本专利技术采用在10%FBS含量的DMEM培养基、N2B27+KSR的培养基中加入CID755673小分子的方法来促进小鼠和人的胚胎干细胞的自我更新，在此种培养条件下，细胞生长情况良好，能够短暂维持人和小鼠胚胎干细胞的自我更新；（2）小鼠胚胎干细胞的培养中加入CID755673与PD0325901两种小分子，人胚胎干细胞培养中加入CRT0066101小分子，可以使细胞维持在最佳的生长状态，长期促进胚胎干细胞的自我更新，简化操作步骤和流程，利于基础研究的开展；（3）与现有的人和小鼠胚胎干细胞培养条件而言，本专利技术具有更加经济高效的优点，改善了人和小鼠胚胎干细胞培养过程中出现的分化现象，可显著节省培养成本和时间；同时，简化细胞因子的添加种类，优化了培养体系，有利于后续对细胞内相关信号通路与分子调控机制展开深入探究；（4）本专利技术所摸索出的培养条件，可以为改善目前人和小鼠胚胎干细胞以及其他种类多能性干细胞的培养条件提供线索。附图说明图1所示为三种条件下培养的P5代小鼠胚胎干细胞在相差本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法，其特征在于，在DMEM培养基、N2B27+KSR的培养基中，加入CID755673小分子化合物来维持小鼠和人的胚胎干细胞的自我更新状态，包括人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养和小鼠的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养。

【技术特征摘要】
1.一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法，其特征在于，在DMEM培养基、N2B27+KSR的培养基中，加入CID755673小分子化合物来维持小鼠和人的胚胎干细胞的自我更新状态，包括人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养和小鼠的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养。2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养，包括以下步骤：（1）取一个6孔细胞培养板，每孔用2mlDMEM+10µlMatrigel包板，置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内，包被4h；（2）取生长至70-80%密度的人的胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，除去细胞表面残留的培养液；（3）加入1mlCTK消化胚胎干细胞，6-8min后，细胞边缘浮起，弃CTK，加2ml含10%FBS的常规细胞培养液，用移液器吹打，将细胞从培养板上吹打下来，然后转移至15ml无菌离心管中；（4）1200rpm，离心4min后，吸去上清；（5）加2ml含10%KSR的N2B27重悬细胞；（6）在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；（7）取已包被好的培养皿，弃包板溶液，PBS洗一遍，向培养板每孔内加入2mlN2B27+KSR培养基；（8）向培养基中加入5×104个细胞，水平十字形晃动，使细胞均匀分布；（9）加入10µmol的CID755673小分子，水平十字形晃动，使其混合均匀；（10）将细胞培养皿置于37℃、5%CO2浓度的细胞培养箱内培养。3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述步骤3中的CTK含有1%CollagenaseIV、0.25%Trypsin、20%KSR、1mMCaCl2的PBS。4.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶守东，朱振华，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34