人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白定量检测卡及其临床应用制造技术

本发明专利技术涉及人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白定量检测卡及其临床应用。本发明专利技术制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足定量检测卡需求的一组抗体组合(NG02及NG19)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血液或尿液样本检测的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。

Quantitative Detection Card of Human Neutrophil Gelatinase Related Lipid Carrier Protein and Its Clinical Application

The invention relates to a human neutrophil gelatinase-related lipid carrier protein quantitative detection card and its clinical application. The invention has prepared a variety of antibodies and screened them pairwise to obtain a set of antibody combinations (NG02 and NG19) with sensitivity and specificity that can meet the needs of quantitative detection cards, and is convenient for mass production and can meet the needs of large-scale clinical application in the future. A colloidal gold immunochromatographic quantitative detection card for human neutrophil gelatinase-related lipid-carrying proteins was obtained by debugging and optimizing the detection system for the above antibody combinations, which is simple to operate, sensitive, specific and relevant detection performance can meet the requirements of human blood or urine samples.

【技术实现步骤摘要】
人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白定量检测卡及其临床应用
本专利技术属于生物
，具体的涉及两种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其制备方法以及上述抗体在人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白定量检测中的应用。
技术介绍
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)，又称载脂蛋白-2(Lipocalin-2)，属于lipocalin超家族的成员，是一种相对分子质量为25kDa的分泌型糖蛋白。在一系列临床研究中，已证明NGAL对于急性肾损伤具有诊断和评估预后的价值。目前，NGAL是诊断急性肾损伤的重要标志物。发生急性肾损伤时血、尿NGAL的水平均升高。因此，尿和血中NGAL检测可作为诊断急性肾损伤的早期、敏感且极具特异性的生物学标志物。NGAL的检测最初采用免疫印迹法(WesternBlot)，但由于该方法灵敏度和精密度低、操作复杂、重复性差等缺点现在已很少用于NGAL的定量研究。2005年丹麦BioPorto公司首先推出酶联免疫吸附法(ELISA)商品试剂盒，可用于血清(浆)、尿液的NGAL检测，标本量需100μL，检测周期约4h，检测限达到0.1ng/mL。随后，有适用于全自动免疫分析仪的分析系统面世，如美国雅培公司的Architecti2000SR全自动免疫分析仪测定尿液NGAL(化学发光微粒子免疫分析法)，标本量需150μL，检测周期约28h。化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定仪器，难以在临床上普及应用；美国博适公司的Triage分析仪检测EDTA抗凝血浆或全血(双抗体夹心免疫荧光层析法)，15h即可完成NGAL的测定，检测范围50～2000ng/mL。这些检测系统只能单一的检测尿液或者血浆，且标本用量大，检测周期长，检测范围窄，限制了其在临床的常规应用。本试剂盒采用胶体金法，该法快速、简便，易操作，自动化程度高，且与ELISA法、免疫比浊法等均具有很好的相关性，临床应用非常广泛，与其他方法检测试剂比较，通用性较强。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一组能有效的、特异性结合人NGAL的抗体对。本专利技术的第一目的在于提供两种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。第一种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体(NG02)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：1所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：4所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO：6所示的LCDR3。优选的是本专利技术中NG02抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。第二种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体(NG19)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：9所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQIDNO：11所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：12所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQIDNO：14所示的LCDR3。优选的是本专利技术中NG19抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示。本专利技术第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体NG02的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示；所述单链抗体NG19的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示。本专利技术第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体NG02的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示、编码单链抗体NG19的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。本专利技术第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。本专利技术第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主菌。本专利技术第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。本专利技术的第七个目的在于提供上述抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体在检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量中的应用。本专利技术的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的抗体对组合；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。本专利技术的第九个目的在于提供一种利用所述抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体NG02，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体NG19。所述分封闭液是1％-10％BSA、0.01MPB溶液，pH7.4。所述金标抗体复溶液是1％-10％BSA、5％海藻糖、0.025％tween20、0.01MPB溶液，pH7.4。所述抗体包被液是0.25％-0.5％BSA、0.01MPB溶液，pH7.4。所述样本稀释液是0.1％Proclin300、0.01MPBS溶液，pH7.4；所述样本稀释液还含有2％BSA或2％-2.5％tween20。所述质控带位置包被抗His标签抗体或ProteinL。所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所述抗His标签抗体优选鼠抗His抗体。本专利技术制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的一组抗体组合(NG02及NG19)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血液或尿液样本检测的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。附图说明图1：抗体NG02及NG19特异性检测效果图(WesternBlot)。其中图1(a)为抗体NG02；图1(b)为抗体NG19。泳道1为标准蛋白质(Marker)；泳道2为人重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白图2：本专利技术胶体金免疫层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为金标垫、7为PVC片材。图3：实施例6NGAL检测卡(19-02)拟合曲线图4：实施例6NGAL检测卡(19-02)线性范围图5：实施例6NGAL检测卡(19-02)方法学比对相关性具体实施方式定义“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将VL的N端连接至VH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的标记抗体，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有包被抗体；所述标记抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3；所述包被抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。

【技术特征摘要】
1.人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的标记抗体，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有包被抗体；所述标记抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：1所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：2所示的HCDR2和如序列SEQIDNO：3所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：4所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：5所示的LCDR2和如序列SEQIDNO：6所示的LCDR3；所述包被抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：9所示的HCDR1、如序列SEQIDNO：10所示的HCDR2和如序列SEQIDNO：11所示的HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQIDNO：12所示的LCDR1、如序列SEQIDNO：13所示的LCDR2和如序列SEQIDNO：14所示的LCDR3。2.权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，所述标记抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。3.权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，所述包被抗体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，丁娜，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32