检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金层析试纸条及其制备方法与应用，属于免疫学技术领域和食品安全分析技术领域。该试纸条结构包括底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护膜，所述样品垫、胶体金垫、包被膜、吸水垫依次粘贴于底板上；胶体金垫上包被有胶体金标记的捕获抗体；包被膜上设有检测抗体溶液印制的隐形检测线，以及用羊抗小鼠IgG溶液印制的隐形质控线。所述捕获抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2018217的杂交瘤细胞株3A8分泌得到，所述检测抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2018218的杂交瘤细胞株3D3分泌得到。本发明专利技术的胶体金层析检测试纸条具有便捷、快速、直观、时效性强等特点，适用范围广，成本低，便于推广应用。

Colloidal gold immunochromatographic strip for detection of troponin I in bovine or sheep skeletal muscle and its application

The invention relates to a colloidal gold chromatographic strip for detecting troponin I in bovine or sheep skeletal muscle, a preparation method and application thereof, belonging to the field of immunology and food safety analysis technology. The structure of the test strip includes a bottom plate, a sample pad, a colloidal gold pad, a coating film and a water absorbent pad. The two ends of the test strip are provided with a protective film. The sample pad, a colloidal gold pad, a coating film and a water absorbent pad are pasted on the bottom plate in turn; the colloidal gold pad is coated with a colloidal gold labeled capture antibody; the coating film is provided with an invisible detection line printed with an antibody solution and an anti-mouse IgG solution. Printed invisible quality control line. The captured antibody is secreted by the hybridoma cell line 3A8 with the preservation number CCTCC NO: C2018217, and the detected antibody is secreted by the hybridoma cell line 3D3 with the preservation number CCTCC NO: C2018218. The colloidal gold chromatographic test strip of the invention has the advantages of convenience, rapidity, intuition, strong timeliness, wide application scope, low cost and easy popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条及应用
本专利技术涉及一种检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法与应用，属于免疫学
和食品安全分析

技术介绍
在肉类食品中，由于价格、宗教、健康等原因，许多国家制定法规要求食品标签真实明确地标出肉类来源，禁止掺假行为，以保护消费者的利益，但是市场上混淆肉类品种的现象仍然非常普遍，掺假的方式包括掺兑、混入、抽取、假冒等手段，尤其以牛、羊肉制品的掺杂、掺假的行为最为常见，这些掺假行为极大地损害了消费者的利益。目前，国内外许多实验室都使用分子生物学技术手段检测肉制品中的源性成分，DNA检测方法手段多样，主要为核酸探针杂交、DNA指纹分析、PCR特异扩增、PCR-RFLP等。这些方法具有一定的灵敏度，但同时也存在着成本高、对检测对象要求高、工作量大、不能现场检测等缺点，尤其是对于熟肉制品检测有很大不确定性，因为这很大程度上依赖于熟肉制品的处理过程，生产过程的多样性导致了基因物质的不同降解水平。再者，该方法只能检测动物DNA的可能来源，必须时刻防止交叉污染，乳汁、血液、脂肪都有可能是DNA的来源。因此，需要其他的方法来与他它的检测结果相互印证。免疫学方法具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便等特点，适于大批量样品筛选，其中酶联免疫吸附法和胶体金试纸条是最常用的方法。然而熟肉制品一般都要经过高温、高压处理，在这个过程中许多蛋白都发生了变性，失去了抗原性和水溶性，这就给免疫学方法的建立带来了困难。要想将免疫学法应用于动物源性成分的检测，必须找到一个特异性的热稳定的蛋白质作为标志物抗原，然后研制出针对此抗原的特异性的单克隆抗体。动物骨骼肌中的肌钙蛋白I(TnI)具有种属专一性，可以作为一种耐热种类标志蛋白，区分不同种属生、熟肉制品的肉种类来源。以牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I(skTnI)为目标检测物，能实现牛或羊肉源性成分免疫学检测鉴别技术的建立。因此，牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I胶体金免疫层析试纸条的制备对于开展牛肉或羊肉肉源成分的免疫学检验鉴定工作具有重要的实际意义和社会意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术缺陷提供一种检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条，该胶体金免疫层析试纸条具有操作简单，快速，适合大批量样品初筛的优点。此外，本专利技术进一步提供该检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条的制备方法与应用。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案实现的。一种检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条，该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，试纸两端设有保护膜；所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上；其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的捕获抗体，包被膜上含有用检测抗体预包被检测线T线，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线C线，两条线竖直平行排列。上述胶体金免疫层析试纸条，所述捕获抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018217的杂交瘤细胞株3A8分泌得到，所述检测抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018218的杂交瘤细胞株3D3分泌得到；两株细胞株于2018年12月20日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。上述胶体金免疫层析试纸条，所述捕获抗体和检测抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源单克隆抗体，优选鼠源单克隆抗体；其由牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I提取免疫抗原免疫得到。上述胶体金免疫层析试纸条，所述底板为PVC条或其它不吸水的硬质材料；所述样品垫和胶体金垫由玻璃纤维棉制成；所述吸水垫由吸水滤纸制成；所述包被膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为不透明的胶膜。本专利技术所述的胶体金层析试纸条制备方法，包括如下步骤：(1)制备胶体金标记的捕获抗体：将待标记的捕获抗体(3D3)溶液10000r/min离心30min；取胶体金溶液10mL，用0.1mol/LK2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量捕获抗体溶液，磁力搅拌下与胶体金溶液混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用每升含10gBSA、0.5g叠氮钠、浓度为0.02mol/L的Na2B4O7溶液稀释，即获得胶体金标记的捕获抗体，4℃保存备用；(2)胶体金垫制备：按规格裁取玻璃纤维棉，将胶体金标记的捕获抗体用喷金仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用；(3)检测线和质控线的制备：将检测抗体(3A8)放于喷金仪贮存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5cm的直线式隐形检测线和隐形质控线，自然干燥，密封，4℃保存备用；(4)试纸条组装：将样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫按顺序依次粘贴于底板上，并在试纸条两端的表面粘贴保护膜，在切槽机上切割成试纸条。所述的胶体金层析试纸条在用于生鲜肉及其制品中牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的应用。上述在用于检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的应用，包括如下步骤：(1)样品前处理生鲜肉类去除脂肪和结缔组织，加工肉类食品去掉肠衣，称取1g加入0.15M的NaCL溶液2ml(1:2w/v)，匀浆后用沸水加热20min，2000g离心30min；去除沉淀，上清用Whatman1号滤纸过滤，收集滤液用于检测；(2)用胶体金层析试纸条检测从包装中取出所述检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条，将样品端插入待测样品液中，插入深度不超过标记线，约10-20秒钟取出检测试纸条，水平放置，3-5分钟观察判定检测结果，10分钟以后结果无效；(3)结果判定(a)阳性：如果包被膜上对应的质控区C位置显示一条棕红色线，检测区T位置显示棕红色线，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I；(b)阴性：如果在包被膜上T位置不显色，在C位置显示有一条棕红色线，表示结果为阴性，说明在待测样品中不含牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I；(c)失效：当质控区C不显示出棕红色条带，则无论检测区T显示出棕红色条带与否该试纸均判为无效。本专利技术的胶体金层析试纸条对牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的最低检测限为20mg/L，对牛羊肉的检测灵敏度为5％，与鸡、鸭、猪骨骼肌肌钙蛋白I提取物交叉反应率低于0.1％。用本专利技术胶体金层析试纸条检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1本专利技术所述检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I胶体金层析试纸条试纸剖面结构示意图图2本专利技术所述检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I胶体金层析试纸条试纸俯视结构示意图图3本专利技术所述检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I胶体金层析试纸条试纸结果判定图图4本专利技术所述检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I胶体金层析试纸条试纸灵敏度测定图，图4a彩色图、图4b黑白图本专利技术所述的抗牛骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的杂交瘤细胞株skTnI-3A8，已于2018年12月20日送交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)保藏，保藏编号CCTCCNO:C2018217。本专利技术所述的抗羊骨骼肌肌钙蛋白I单克隆抗体的杂交瘤细胞株skTnI-3D3，已于2018年12月20日送交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，试纸两端设有保护膜；所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上；其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的捕获抗体，包被膜上含有用检测抗体预包被检测线T线，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线C线，两条线竖直平行排列。

【技术特征摘要】
1.一种检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，试纸两端设有保护膜；所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上；其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的捕获抗体，包被膜上含有用检测抗体预包被检测线T线，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线C线，两条线竖直平行排列。2.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述底板为PVC条或其它不吸水的硬质材料；所述样品垫和胶体金垫由玻璃纤维棉制成；所述吸水垫由吸水滤纸制成；所述包被膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为不透明的胶膜。3.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述捕获抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018217的杂交瘤细胞株3A8分泌得到，所述检测抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2018218的杂交瘤细胞株3D3分泌得到；两株细胞株于2018年12月20日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。4.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述捕获抗体和检测抗体为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源单克隆抗体，优选鼠源单克隆抗体；其由牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I提取免疫抗原免疫得到。5.制备如权利要求1所述检测检测牛或羊骨骼肌肌钙蛋白I胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备胶体金标记的捕获抗体：将待标记的捕获抗体(3D3)溶液10000r/min离心30min；取胶体金溶液10mL，用0.1mol/LK2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量捕获抗体溶液，磁力搅拌下与胶体金溶液混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用每升含10gBSA、0.5g叠氮钠、浓度为0.02mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春生，吴萌，张岩，李云，刘静静，张静，曹秀梅，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13