高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于时间分段技术的高效液相色谱‑串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法，步骤是：A.称取水产品肌肉组织，加入乙腈含1%甲酸、无水硫酸镁、ODS提取净化；B.采用高效液相色谱‑串联质谱进行正负离子模式切换和分时间段检测水产品肌肉中盐酸氯苯胍、对氯苯甲酸、对氯苯甲酰胺乙酸的残留量；C.标准曲线法定量：盐酸氯苯胍采用内标法定量，盐酸氯苯胍‑d8作内标，对氯苯甲酰氨基乙酸和对氯苯甲酸采用外标法定量。该方法操作简便，基质效应低、检测限低、准确度和精密度高。

Determination of chlorophenylguanidine hydrochloride and its metabolite residues in aquatic products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

The invention discloses a method for the determination of chlorophenylguanidine hydrochloride and its metabolite residues in aquatic products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry based on time-segment technology. The steps are: A. weighing the muscle tissue of aquatic products, adding acetonitrile containing 1% formic acid, anhydrous magnesium sulfate and ODS to extract and purify; B. switching of positive and negative ion modes and time-segment detection by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The residues of chlorophenylguanidine hydrochloride, p-chlorobenzoic acid and p-chlorobenzamide acetic acid in muscle of aquatic products were determined. C. Standard curve method: chlorophenylguanidine hydrochloride was quantified by internal standard method, chlorophenylguanidine hydrochloride D8 was used as internal standard, and p-chlorobenzoyl aminoacetic acid and p-chlorobenzoic acid were quantified by external standard method. The method is simple, low matrix effect, low detection limit, high accuracy and precision.

【技术实现步骤摘要】
高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法
本专利技术属于水产品安全检测
，具体涉及一种基于时间分段技术的高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法。
技术介绍
盐酸氯苯胍(1,3-双(对氯苄叉氨基)胍盐酸盐)属于胍基衍生物，是一种非手性化学合成药物。盐酸氯苯胍-d8是由重氢原子代替盐酸氯苯胍两个苯环上的8个氢原子形成的。盐酸氯苯胍在欧洲被允许作为饲料添加剂防治肉鸡、火鸡和兔子体内球虫病。在我国盐酸氯苯胍被用于治疗鱼类孢子虫病。研究表明，预防性饲喂盐酸氯苯胍能完全预防由球虫引起的鲫的小肠炎。盐酸氯苯胍在动物源性食品(包括水产品)中的大量使用，很容易在动物源性食品(包括水产品)中造成残留，人体长期摄入含有盐酸氯苯胍残留的动物源性食品(包括水产品)容易导致药物在人体内蓄积，进而对人类的身体健康产生很大的危害。为了避免消费者由于摄入含有盐酸氯苯胍残留的动物源性食品(包括水产品)引起的健康风险，欧洲食品安全局基于毒理学数据制定了盐酸氯苯胍的每日允许摄入量(ADI)为0.11mg/kg体重。欧盟也制定了盐酸氯苯胍在除肉鸡、火鸡和兔子外的动物源性食品肝脏、肾脏、皮肤和脂肪(湿重)中的最大残留限量值(MRLs)为50μg/kg，其他食品(包括水产品)中最大残留限量值为5μg/kg。可见，盐酸氯苯胍在水产品中的残留问题越来越受到人们关注。为更全面的评价含盐酸氯苯胍残留的水产品的风险，保障水产品质量安全，进而保护人类的健康，提供一种可靠的定性、定量方法分析水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留是非常必要的，但目前国内外仅见有一篇关于水产品肌肉中盐酸氯苯胍及其代谢物检测的超高效液相色谱法文献报道，但该方法中盐酸氯苯胍、对氯苯甲酰氨基乙酸和对氯苯甲酸的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为25μg/kg和50μg/kg，不能满足欧盟对水产品中盐酸氯苯胍残留检测的要求，最大残留限量的要求(MRLs为5μg/kg)。因此有必要开发一种灵敏度更高、操作方便、准确、快速测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢产物对氯苯甲酸和对氯苯甲酰胺乙酸残留量的检测方法，本专利技术提供了一种基于时间分段技术的高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物对氯苯甲酸和对氯苯甲酰胺乙酸残留量的方法。目前，国内外未见有高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物对氯苯甲酸和对氯苯甲酰胺乙酸残留量方法的报道或专利申请。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种基于时间分段技术的高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物对氯苯甲酸和对氯苯甲酰胺乙酸残留量的方法。采用高效液相色谱-加热电喷雾电离源-串联四级杆质谱仪及预设分段时间的方法建立了水产品肌肉组织中盐酸氯苯胍及其代谢物对氯苯甲酰氨基乙酸和对氯苯甲酸残留量的测定方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于时间分段技术的高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法，其步骤是：A、肌肉样品进行处理：称取匀质的肌肉样品，加入盐酸氯苯胍-d8作为盐酸氯苯胍的内标，依次加入提取剂A、无水硫酸镁涡旋振荡，离心后取上清液，重复提取残留物合并提取液，再加入无水硫酸镁和净化剂B，涡旋振荡并离心，取上清液氮气吹干，残渣用体积比为70:30-80:20的甲醇和水混合液溶解，经孔径不大于0.22μm的滤膜过滤，滤液供HPLC-HESI-MS/MS检测；B、HPLC分析条件：色谱柱：C18色谱柱(100mm×2.1mm，3.5μm)；柱温：30℃，流速：0.25mL/min；流动相：有机相为甲醇，水相为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序：起始梯度为体积浓度25％-35％的甲醇，4.5min内线性增加到体积浓度为85％-95％的甲醇，保持2.5min，0.1min内线性降低到体积浓度为25％-35％的甲醇，最后维持0.9min，进样体积为20μL；C、HESI-MS/MS分析条件：加热电喷雾离子源，正离子模式和负离子模式切换；检测方式采用选择反应监测模式；正离子模式喷雾电压：3500V，负离子模式喷雾电压：-3000v；蒸发气温度：380℃；鞘气压力50arb；辅助气压力15arb；碰撞气及压力：氩气纯度≥99.999，1.5mTorr；离子传输毛细管温度：350℃；Q1的半峰宽设为0.7，Q3的半峰宽设为0.7，检测参数具体如下：*定量离子D、标准曲线法定量：盐酸氯苯胍采用内标法建立标准曲线，对氯苯甲酸、对氯苯甲酰胺乙酸采用外标法建立标准曲线，并据此计算样品浓度。进一步地，所述的时间分段1为0-5.3min、分段2为5.3-6.0min、分段3为6.0-8.0min。优选地，所述的提取剂A是乙腈含1％甲酸。优选地，所述的净化剂B是十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：(1)本专利技术采用高效液相色谱-串联质谱进行离子模式切换和分时间段进行检测，方法操作简便，检测限低、灵敏度、准确度和精密度高，结果见表2和表3。(2)本专利技术可用于盐酸氯苯胍给药后水产动物肌肉组织中盐酸氯苯胍及其代谢物对氯苯甲酸和对氯苯甲酰胺乙酸浓度的测定，进而用于盐酸氯苯胍在水产动物中药动学和残留消除规律研究。附图说明图1为不同提取剂对盐酸氯苯胍、盐酸氯苯胍-d8、对氯苯甲酰胺乙酸和对氯苯甲酸回收率的影响。图2为不同净化剂对盐酸氯苯胍、盐酸氯苯胍-d8、对氯苯甲酰胺乙酸和对氯苯甲酸回收率的影响。图3为实施例2中草鱼肌肉组织中盐酸氯苯胍、对氯苯甲酰胺乙酸和对氯苯甲酸加标样品的HPLC-HESI-MS/MS色谱图。1-对氯苯甲酸色谱图，2-对氯苯甲酰胺乙酸色谱图，3-盐酸氯苯胍色谱图，4-盐酸氯苯胍-d8色谱图。图4为实施例3中口灌盐酸氯苯胍后草鱼肌肉中盐酸氯苯胍、对氯苯甲酰胺乙酸和对氯苯甲酸的HPLC-HESI-MS/MS色谱图。1-对氯苯甲酸色谱图，2-对氯苯甲酰胺乙酸色谱图，3-盐酸氯苯胍色谱图，4-盐酸氯苯胍-d8色谱图。图5为实施例3中口灌盐酸氯苯胍后草鱼肌肉样品中盐酸氯苯胍及其代谢物对氯苯甲酸的浓度变化。具体实施方式实施例1高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法优化1、质谱条件的优化分别将10mg/L的盐酸氯苯胍、盐酸氯苯胍-d8、对氯苯甲酰胺乙酸和对氯苯甲酸通过注射泵注入到质谱中，通过上述目标物在正离子和负离子模式下的响应度选择合适的检测模式，结果表明，盐酸氯苯胍和盐酸氯苯胍-d8在正离子模式下的响应度是其在负离子模式下的5倍和3倍。而对氯苯甲酰胺乙酸和对氯苯甲酸在负离子模式下的响应值是正离子模式下的2倍和1倍。因此，盐酸氯苯胍和盐酸氯苯胍-d8在正离子模式下分析，而对氯苯甲酰胺乙酸和对氯苯甲酸则在负离子模式下分析。2、分段时间的确定由于盐酸氯苯胍和盐酸氯苯胍-d8在正离子模式下质谱检测的响应度高，而对氯苯甲酰胺乙酸和对氯苯甲酸在负离子模式下质谱检测的响应度高。如果采用正负离子实时切换检测分析物，会降低分析物的响应度，进而会使分析物的检测限变高，不利于样品中低含量分析物的定性、定量检测。本申请尝试了不同的洗脱程序，最终选用如下程序：起始梯度为体积浓度25％-35％的甲醇，4.5min内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于时间分段技术的高效液相色谱‑串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法，其步骤是：A、肌肉样品进行处理：称取匀质的肌肉样品，加入盐酸氯苯胍‑d8作为盐酸氯苯胍的内标，依次加入提取剂A、无水硫酸镁涡旋振荡，离心后取上清液，重复提取残留物合并提取液，再加入无水硫酸镁和净化剂B，涡旋振荡并离心，取上清液氮气吹干，残渣用体积比为70:30‑80:20的甲醇和水混合液溶解，经孔径不大于0.22μm的滤膜过滤，滤液供HPLC‑HESI‑MS/MS检测；B、HPLC分析条件：C18色谱柱，100mm×2.1mm，3.5μm；柱温：30℃，流速：0.25mL/min；流动相：有机相为甲醇，水相为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序：起始梯度为体积浓度25％‑35％的甲醇，4.5min内线性增加到体积浓度为85％‑95％的甲醇，保持2.5min，0.1min内线性降低到体积浓度为25％‑35％的甲醇，最后维持0.9min，进样体积为20μL；C、HESI‑MS/MS分析条件：加热电喷雾离子源，正离子模式和负离子模式切换；检测方式采用选择反应监测模式；正离子模式喷雾电压：3500V，负离子模式喷雾电压：‑3000v；蒸发气温度：380℃；鞘气压力50arb；辅助气压力15arb；碰撞气及压力：氩气纯度≥99.999，1.5m Torr；离子传输毛细管温度：350℃；Q1的半峰宽设为0.7，Q3的半峰宽设为0.7，检测参数具体如下：...

【技术特征摘要】
1.一种基于时间分段技术的高效液相色谱-串联质谱测定水产品中盐酸氯苯胍及其代谢物残留量的方法，其步骤是：A、肌肉样品进行处理：称取匀质的肌肉样品，加入盐酸氯苯胍-d8作为盐酸氯苯胍的内标，依次加入提取剂A、无水硫酸镁涡旋振荡，离心后取上清液，重复提取残留物合并提取液，再加入无水硫酸镁和净化剂B，涡旋振荡并离心，取上清液氮气吹干，残渣用体积比为70:30-80:20的甲醇和水混合液溶解，经孔径不大于0.22μm的滤膜过滤，滤液供HPLC-HESI-MS/MS检测；B、HPLC分析条件：C18色谱柱，100mm×2.1mm，3.5μm；柱温：30℃，流速：0.25mL/min；流动相：有机相为甲醇，水相为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序：起始梯度为体积浓度25％-35％的甲醇，4.5min内线性增加到体积浓度为85％-95％的甲醇，保持2.5min，0.1min内线性降低到体积浓度为25％-35％的甲醇，最后维持0.9min，进样体积为20μL；C、HESI-MS/MS分析条件：加热电喷雾离子源，正离子模式和负离子模式切换；检测方式采用选择反应监测模...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永涛，王桢月，艾晓辉，董靖，胥宁，杨秋红，杨移斌，周顺，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42